[发明专利]类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶粗提物及制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种类芽孢杆菌CGMCC No.8333凝乳酶粗提物及制备方法。

背景技术

与植物来源和动物来源的凝乳酶相比较，微生物来源的凝乳酶具有生产成本低、生化多样性高、基因易改造的优势。目前，越来越多的报道说明微生物的胞外蛋白酶具有凝乳功能，部分微生物的凝乳酶已实现大规模工业化生产，并广泛应用于干酪生产中。能够产生具有一定凝乳作用的胞外蛋白酶的微生物主要属于放线菌、细菌和霉菌等的范畴，包括放线菌中的链霉菌属、小单孢菌属、马杜拉放线菌属，霉菌中根霉、总状毛霉、微小毛霉、米黑毛霉、易脆毛霉，细菌中粟疫菌、寄生内座壳菌以及其他通过基因工程或辐照获得的高产凝乳酶的菌株。

将凝乳酶从发酵上清中分离出来并实现凝乳酶的高效回收是分离纯化、酶学性质研究以及工业化生产凝乳酶的前提和基础。常用的分离方法有盐析法、有机溶剂沉淀法(乙醇、丙酮)以及等电点法。然而这些方法适用于发酵上清黏度很低或不含有微生物胞外多糖的情况。因此，探索开发一种能够有效降低发酵液中糖类含量的发酵方式，对于分离纯化微生物源凝乳酶有着重要的意义。

中国专利申请(CN103740618A)公开了类芽孢杆菌属的一个新菌种类芽孢杆菌BD3526，Paenibacillusdamxungensissp.nov.，并且芽孢杆菌BD3526于2013年10月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，该菌株的保藏编号为：CGMCC No.8333。该菌株的菌落非常粘稠，表明该菌株具有高产胞外多糖的生理特性。但是目前没有从该菌株中获得多糖含量较少的凝乳酶的记载。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，针对目前利用类芽孢杆菌麸皮发酵物制备凝乳酶时，所得的发酵物粘稠难以将凝乳酶纯化分离，所得的凝乳酶回收率低，难以满足大规模工业化生产的要求的不足，提供一种类芽孢杆菌CGMCC No.8333的凝乳酶粗提物及其制备方法。该方法在保证凝乳酶凝乳活力的前提下，有效降低了因多糖导致的发酵物黏度增加对凝乳酶提取分离的影响。利用本发明所述的方法获得的凝乳酶多糖等杂质含量较少，便于大规模工业化生产。

本发明的发明人发现，由于类芽孢杆菌CGMCC No.8333的发酵液中胞外多糖含量较高造成所得类芽孢杆菌发酵液较为粘稠，采用乙醇沉淀类芽孢杆菌CGMCC No.8333的发酵液时，多糖类代谢产物易伴随蛋白质沉淀析出。使离心后的上清液存在大量的糖类，粘度过大，为后续凝乳酶的分离纯化带来一定的困难。然而通过适当延长类芽孢杆菌的发酵培养时间、改变接种量以及降低摇床转速等培养方式，能使发酵液中的胞外多糖物质被类芽孢杆菌代谢，降低培养物中胞外多糖类物质含量，同时结合后续发酵液的提纯工艺，能够进一步降低所得凝乳酶中的杂质，以提高类芽孢杆菌凝乳酶的回收率。

本发明提供一种制备类芽孢杆菌CGMCC No.8333的凝乳酶粗提物的方法，其包括以下的步骤：

(1)将保藏编号为CGMCC No.8333的类芽孢杆菌的种子液以0.4～3.2％的接种量接种于麸皮培养基震荡发酵培养24～72小时得发酵液，所述震荡发酵培养的转速为160～180r/min，所述百分比为体积百分比；

(2)将步骤(1)所得的发酵液离心取上清液即得凝乳酶粗提物。