[发明专利]一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法

权利要求书

1.一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，包括以下步骤：

步骤1)，通过支气管镜引导，获取肿瘤组织，去除脂肪组织和坏死组织；

步骤(2)，将步骤(1)获取的肿瘤组织在gentleMACS全自动组织温和处理器中分离出单细胞悬液；

步骤(3)，将步骤(2)制备的单细胞悬液过滤离心，制备成自体肿瘤抗原，灭菌冻存；

步骤(4)制备树突细胞，在制备树突细胞第0小时，将外周血单个核细胞置于OKM100培养基中、36.5-37.5℃CO₂孵箱中培养，培养结束后，轻轻摇晃培养瓶，将细胞悬液转移至新的培养瓶；向剩余贴在培养瓶壁上的外周血单个核细胞中加入OKM100培养基，向OKM100培养基中再加入IL-4及GM-CSF构成的第一体系,置于36.5-37.5℃的CO₂孵箱中开始计算培养时间；

步骤(5)第65-75小时后，将步骤(4)中的OKM100培养基部分换成新鲜的OKM100培养基，继续置于36.5-37.5℃的CO₂孵箱中培养；

步骤(6)第140-150小时后，将步骤(5)中的OKM100培养基部分换成新鲜的OKM100培养基，再加入TNFα构成第二体系，继续置于36.5-37.5℃的CO₂孵箱中培养；

步骤(7)第185-195小时后，加步骤(3)制备的自体肿瘤抗原构成第三体系，使得第三体系中的自体肿瘤抗原浓度为1-100μg/ml，继续置于36.5-37.5℃的CO₂孵箱中培养，4～8小时后收获DC细胞。

2.根据权利要求1所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(1)获取肿瘤组织大小为1～5CM³。

3.根据权利要求2所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(1)获取肿瘤组织大小为1～3.5CM³。

4.根据权利要求3所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(1)获取肿瘤组织大小为2CM³。

5.根据权利要求1至4任一项所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(4)中IL-4及GM-CSF在第一体系中的浓度均为1-2000U/ml。

6.根据权利要求1至4任一项所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(6)中所述TNFα在第二体系中的浓度为1-30ng/ml。

7.根据权利要求1至4任一项所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(4)至(7)中CO₂孵箱中温度为37℃，CO₂浓度为5％。

8.根据权利要求1至4任一项所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(2)单细胞悬液的具体制备过程为：将RPMI1640或者DMEM、EnzymeH、EnzymeR及EnzymeA混合于gentleMACS全自动组织温和处理器配套设备C管中处理，其中所述RPMI1640或者DMEM为1-8.7mL，EnzymeH为1-400μL，EnzymeR为1-400μL，EnzymeA为1-100μL；

步骤(3)所述过滤离心为：将单细胞悬液经过200目一次性尼龙筛网，进行过滤；再经过4℃，10000rpm/min，30min离心，取上清，留样检测蛋白含量及细菌、真菌和支原体，制成制备成自体肿瘤抗原，灭菌冻存于-80℃；

步骤(7)加入自体肿瘤抗原前，将自体肿瘤抗原用0.22μ滤器过滤除菌。

9.根据权利要求1至4任一项所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(7)的第三体系中的自体肿瘤抗原浓度为1-50μg/ml。

10.根据权利要求1至4任一项所述一种支气管镜下获取肿瘤组织进行树突细胞培养扩增方法,其特征在于，步骤(7)收获DC细胞量为1*10⁷。