[发明专利]一种镍-纤维蛋白原螯合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种镍-纤维蛋白原螯合物及其制备方法和应用。

背景技术

纤维蛋白原(fibrinogen，FG)其生理功能主要是作为凝血因子Ⅰ而直接参与凝血过程。在凝血共同途径中，凝血酶先裂解纤维蛋白原两条Aα链氨基端Arg16-Gly17释放出一对纤维蛋白肽A，形成纤维蛋白单体Ⅰ；在裂解纤维蛋白原两条Bβ链氨基端Arg14-Gly15释放出一对纤维蛋白肽B，形成纤维蛋白单体Ⅱ,暴露纤维蛋白单体的聚合部位，通过非共价结合，形成了不稳定的可溶性纤维蛋白单体。在活化的凝血因子XIII及Ca²⁺的作用下，纤维蛋白单体互相交联，生成稳定的可溶性纤维蛋白，并将血液的有形成分包绕其中，形成牢固的血栓。

除参与凝血外，纤维蛋白原还具有其他多种功能，如与血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa结合而介导血小板聚集反应，参与动脉粥样硬化及肿瘤血行转移等；纤维蛋白原水平还影响血液粘度，尤其近年来人们发现血浆纤维蛋白原水平升高是心脑血管、血栓性疾病的重要危险因素。血浆纤维蛋白原也是急性时相蛋白，在很多应激状况下，如感染、严重外伤等也可短时间内升高。

镍作为一种常见的有毒金属，广泛应用于生活、生产之中，包括生产硬币、珠宝、镍合金不锈钢、制造Ni-Cd电池等，与人们的生活息息相关。随着科技的进步，人们将镍作为催化剂用于生产碳纳米颗粒的生产之中，又进一步加深了镍对于人类的影响。对于普通人群，镍主要是通过食入、饮入、接触等方式摄入镍，当然吸烟也是一重要途径。研究发现，过量的镍会导致机体多处组织及器官损伤，导致多种疾病的发生，包括呼吸系统疾病(肺炎、支气管炎、肺纤维化、哮喘、肺水肿等)、心血管疾病、肾脏疾病、皮肤疾病等，甚至还会导致肿瘤的发生。

流行病学资料显示，长期接触镍的工人，其患呼吸系统肿瘤的几率大大增加，并且其因呼吸系统肿瘤致死的几率也大大增加。动物模型、体外模型试验也发现，镍可以诱导肿瘤的发生。1990年，国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)已将镍化合物作为第一类致癌物质(Group 1)，将金属镍作为2B类致癌物质(Group 2B)。可见，镍严重威胁人体的健康。

镍与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。随着对镍毒性研究的深入，人们逐渐认识到镍与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的角色，被认为是了解镍的毒性机理的关键所在，因此，对镍和蛋白质相互作用的研究就显得愈发重要。而现在关于镍与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与镍之间的关系还不清楚，因而加强对于镍与蛋白质之间的关系至关重要。

发明内容

针对镍污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种镍-纤维蛋白原螯合物及其制备方法，并建立镍-纤维蛋白原螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测镍-纤维蛋白原螯合物在评价一个地区镍污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中镍-纤维蛋白原螯合物可以间接反映这个地区人群受镍污染的情况，从而间接反映这个地区镍污染程度。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种镍-纤维蛋白原螯合物，镍离子与纤维蛋白原通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。

本发明还提供一种上述的镍-纤维蛋白原螯合物的制备方法，包括以下步骤：

A)镍与纤维蛋白原的螯合反应：在提纯源于人体的纤维蛋白原或按照生物学方法重组的纤维蛋白原中加入镍离子进行螯合反应，得到反应溶液；

B)纯化镍-纤维蛋白原螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的纤维蛋白原以及多余的镍离子，即得镍-纤维蛋白原螯合物。

其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：

(1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使镍-纤维蛋白原螯合物复溶；

(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与纤维蛋白原特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；

(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上柱，纤维蛋白原与填料特异性结合；

(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；

(5)收集：收集洗脱液Ⅰ；

(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH₂O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；