[发明专利]XRCC2启动子、含有XRCC2启动子的载体、载体的构建及应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种XRCC2启动子、含有XRCC2启动子的载体、载体的构建及应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

肿瘤是严重危害人类健康及生命的疾病之一，其死亡率高居各类疾病之首。因此，除应用传统的手术、放疗及化疗等方式治疗肿瘤以外，不断开发全新的肿瘤治疗方式对于缓解肿瘤给人类健康造成的巨大威胁刻不容缓。随着病理学及分子生物学等学科的不断发展，人们逐渐意识到肿瘤是一种多因素、多步骤和多基因共同参与的“基因病”，多种原癌基因的激活及抑癌基因的失活被认为是肿瘤发生的重要诱因。因此，以改变人遗传物质为基础的基因治疗是针对肿瘤发生根源的本质治疗方法。由于具有针对性强及效果显著等突出优势，基因治疗为肿瘤治疗领域带来了具有里程碑意义的一次革命。

合理利用肿瘤基因组学的改变是肿瘤基因治疗的一种重要策略，其被证实能够特异性靶向肿瘤细胞，而对正常组织影响有限，具有良好的可控性及靶向性。诸多研究表明运用在肿瘤细胞中具有高活性的基因表达调控原件如启动子调控报告基因或自杀基因的表达能够有效应用于肿瘤的诊断及治疗。例如，有研究者构建了由端粒酶催化亚基(hTERT)的启动子控制促凋亡蛋白Caspase8表达的载体，体内外实验均表明其对肿瘤细胞有特异性的杀伤作用；此外，用Rad51启动子调控荧光素酶或自杀基因DTA的表达被证实能够实现体内肿瘤的可视化及靶向性治疗。然而，由于在肿瘤细胞及正常细胞中活性差异不够大而使得肿瘤靶向性不高或启动子片段过长而导致难以利用传统方式将其高水平转运入肿瘤细胞等缺陷，大大限制了已发现的在肿瘤细胞中活性较高的启动子运用于肿瘤基因治疗的可能性。因此，寻找更多有效并具有临床应用前景的在肿瘤细胞中特异性激活的蛋白启动子将为更好地推动肿瘤的基因治疗奠定基础。

XRCC2是DNA同源重组(HR)修复通路关键蛋白分子Rad51家族中的重要成员，其被证实能够与其他Rad51家族蛋白结合共同参与HR修复过程或识别DNA损伤位点，募集修复蛋白，在HR修复的早期阶段发挥重要作用。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种XRCC2启动子、含有XRCC2启动子的载体、载体的构建及应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

技术方案一： 

一种XRCC2启动子，其序列如SEQ ID NO.1所示。

技术方案二： 

一种含有XRCC2启动子的载体，包括pXRCC2-GFP、pXRCC2-Luciferase、pXRCC2-DTA、pXRCC2-其他毒蛋白、AAV-pXRCC2-Luciferase及Fugw-pXRCC2-Luciferase，其中pXRCC2指代XRCC2启动子。

所述的DTA为白喉毒素的A亚基，能够抑制细胞内多种蛋白的合成，具有很强的细胞毒性，其序列如SEQ ID NO.2所示；所述的其他毒蛋白包括凋亡家族蛋白caspase3、caspase6、caspase7、caspase8等能够诱导细胞死亡的蛋白。

技术方案三： 

如技术方案二所述的含有XRCC2启动子的载体的构建方法，具体如下：

(1)pXRCC2-GFP质粒的构建： 

以人皮肤成纤维细胞系细胞的基因组DNA为模板，XRCC2 5’及XRCC2 3’分别为上下游引物，PCR扩增5’端含有EcoRI、3’端含有AgeI酶切位点的pXRCC2序列，将pRad51C-GFP质粒及扩增完成的pXRCC2片段用限制性内切酶EcoRI及AgeI进行酶切，跑胶鉴定并回收相应片段后进行连接反应，构建完成pXRCC2-GFP质粒；

(2)pXRCC2-Luciferase质粒的构建：

以pXRCC2-GFP质粒为模板，采用上下游引物XRCC2-Luciferase 5’及XRCC2-Luciferase 3’PCR扩增两端分别含有NheI及HindIII酶切位点的pXRCC2，将pXRCC2片段与pGL3-basic质粒采用NheI及HindIII进行酶切，跑胶鉴定后，分别回收pXRCC2片段及pGL3-basic质粒的线性化片段并进行连接反应，构建完 成pXRCC2-Luciferase质粒；

(3)pXRCC2-DTA质粒的构建：