[发明专利]一种铅-白蛋白螯合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种铅-白蛋白螯合物及其制备方法和应用。

背景技术

血清白蛋白(HSA)是哺乳动物血浆中含量最丰富的蛋白质，它能够储存和转运众多的内源性和外源性物质，这与它特异性结构密切相关。血清白蛋白是由肝脏合成的一种简单蛋白质，仅由氨基酸组成，没有修饰基团和其他附属物。根据数据资料显示，牛血清白蛋白(BSA)分子由583个氨基酸残基组成。而人血清白蛋白(HSA)比BSA多2个氨基酸，即585个氨基酸残基组成。两者的差异在于BSA缺失HSA氨基酸序列116位和585位的残基。白蛋白氨基酸成分最显著的特征是低含量的色氨酸，HSA和BSA每分子中分别含有1或2个残基。苯丙氨酸和异亮氨酸含量也比较低。半胱氨酸、亮氨酸、谷氨酸和赖氨酸含量都非常高。大量的离子化残基提供了白蛋白非常高的电荷，在PH7的条件下，每分子白蛋白带有185个离子，这样就形成白蛋白易溶性。

白蛋白最独特的结构特点是二硫键模式。BSA序列包含35个半胱氨酸残基，形成17个二硫桥,相邻的半胱氨酸对与链上最近的残基连结，形成10-47个残基长度的一对环。S-S键交迭增加了白蛋白结构的刚性和稳定性。

白蛋白的三级结构被认为是一种高度螺旋的分子，通过X射线衍射得知HPB晶体中大约67％的残基参与形成了28个α一螺旋体，10％残基参与形成β转角，23％残基形成伸展链。

生理机制上，白蛋白维持人体血浆胶体渗透压的80％。另外，白蛋白也是血液中各种大分子物质的主要载体，在代谢物转运、生物转化中发挥着重要作用。它同时也是调节凝血功能和炎性反应的组分。人血清白蛋白主要应用于临床、新陈代谢和遗传方面的研究。

铅(Pb)是一种常见的有毒金属及环境污染物，广泛应用于工业生产环境中，包括冶炼锻造、铅电池生产、汽油添加剂的生产过滤中等，与人们生活息息相关。对于普通人群，主要是通过吸入铅污染的空气，或饮用以铅壶或铅锡壶盛装的酒，甚至使用或滥用含铅的药物治疗慢性疾病而摄入铅。越来越多的研究证明铅可以对机体造成急性、慢性损伤，甚至导致癌症的发生。美国毒物与疾病登记署公布研究表明，铅是一种全身性毒物，可以影响神经、造血、内分泌、免疫、生殖、肝脏、肾脏等组织器官，国际肿瘤研究机构(IARC)也将铅及其化合物列为第2B类人致癌物。可见铅对机体的影响及其重要，不可忽视。

铅与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。随着对铅毒性研究的深入，人们逐渐认识到铅与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的角色，被认为是了解铅的毒性机理的关键所在，因此，对铅和蛋白质相互作用的研究就显得愈发重要。而现在关于铅与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铅之间的关系还不清楚，因而加强对于铅与蛋白质之间的关系至关重要。

发明内容

针对铅污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铅-白蛋白螯合物及其制备方法，并建立铅-白蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铅-白蛋白螯合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-白蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映这个地区铅污染程度。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铅-白蛋白螯合物，铅离子与白蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。

本发明还提供一种上述的铅-白蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：

A)铅与白蛋白的螯合反应：在提纯源于人体的白蛋白或按照生物学方法重组的白蛋白中加入铅离子进行螯合反应，得到反应溶液；

B)纯化铅-白蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的白蛋白以及多余的铅离子，即得铅-白蛋白螯合物。

其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：

(1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铅-白蛋白螯合物复溶；

(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与白蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；

(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上柱，白蛋白与填料特异性结合；

(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；

(5)收集：收集洗脱液Ⅰ；