[发明专利]喹啉或异喹啉类小分子化合物在人多能干细胞培养及冷冻保存中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及喹啉或异喹啉类小分子化合物在人多能干细胞培养及冷冻保存中的应用及实施方法。

背景技术

胚胎干细胞(ESCs)来源于胚胎囊胚的内细胞团，具有无限的增殖能力和多向分化潜能。1998年，美国Wisconsin大学的Tomson等(Tomson et al.，1998)首次从人工体外受精的囊胚内细胞团分离得到人胚胎干细胞，并成功进行体外培养建系。因其可在体外无限繁殖，并能分化成三个胚层来源的各种细胞类型，故人胚胎干细胞成为再生医学、组织工程、药物筛选、发育生物学研亢等领域的研亢热点(Ohgushi and Sasai，2011)。由于人胚胎干细胞建立涉及伦理道德和法律等问题，其研亢与应用受到很大限制。日本学者Shinya Yamanaka在2006年和2007年，通过导入四个转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)，首次分别将小鼠和人的皮肤成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞(Takahashi andYamanaka，2006；Takahashi et al.，2007)，并因此贡献获得了2012年的诺贝尔生理学或医学奖。此后，不同的研亢组分别使用修饰的方法获得了诱导多能干细胞。诱导多能干细胞与胚胎干细胞同为多能干细胞，具有与胚胎干细胞相同的体外无限扩增和分化能力，并且不存在伦理道德和法律等的问题，因此在再生医学和组织工程领域具有广阔的应用前景和巨大的经济价值。另一方面，可根据需要从患者来源的细胞获得诱导多能干细胞，这为将来的个体化治疗带来了希望。

人多能干细胞最初的培养条件由生长在明胶等基底包被的细胞培养器皿中，并由鼠胚胎成纤维细胞或其它成纤维细胞等饲养层细胞支持，同时还需要敲除血清替代品作为主要的培养基添加剂。含饲养层的培养方法相对比较繁琐，价格昂贵，而且生长环境中含有动物源成分，有可能引起免疫排斥反应或者引入病毒，这对严重限制了基础研亢及其临床应用。研亢者们开始探讨开发无饲养层的人多能干细胞培养方法，关于人多能干细胞无饲养层培养的方法的报道越来越多。包含细胞粘附分子，如层粘连蛋白、玻连蛋白和纤连蛋白等的基质胶被证明可以提高无饲养层培养条件下人多能干细胞的存活和克隆形成。Matrigel，是从富含胞外基质蛋白的EHS小鼠肿瘤中提取的基质胶，目前在人多能干细胞研亢中被广泛应用。无饲养层细胞的培养方式给人多能干细胞的研亢及应用带来了极大的便利，将逐渐代替饲养层的培养方式。然而相对于含饲养层的培养方式，用无饲养层的培养方式获得人多能干细胞要困难的多，细胞的存活率和克隆形成率很低。因此，改进无饲养层的培养条件以促进人多能干细胞存活和克隆形成是未来的一个重要的研亢方向。

为了实现多能干细胞的应用，必需对其进行体外扩增以获得大量的细胞源，并实现高效冷冻保存。然而，人多能干细胞在培养操作过程中极易发生大量的细胞死亡，这成为其体外扩增、基础研亢和临床应用的巨大障碍。细胞体外扩增和冷冻保存过程涉及细胞解离、冷冻保护剂移入、超低温冷冻保存、快速复苏、冷冻保护剂移出等步骤。但是，解离成单细胞的人多能干细胞极易发生大量的细胞凋亡(Ohgushi et al.，2010)，以致无法进行后续操作。另外，超低温慢速冷冻后虽然人胚胎干细胞的细胞膜能够维持其完整性，但细胞的功能却受到损害，大量细胞在复苏过程发生细胞凋亡，从而导致极低的复苏率(Heng et al.，2006)。针对这些问题，目前国内外很多研亢者正试图通过改变细胞解离方法、改进低温冷冻方法、筛选新型冷冻保护剂和研亢细胞凋亡机理等方面寻找稳定、可靠的人多能干细胞培养和保存技术，为科学研亢及临床应用提供保障。虽然这些工作取得了一定的进展，但是至今仍然没有一个简单可靠、价格低廉、重复性强的提高人多能干细胞成活率的培养及冷冻保存方法。

发明内容

本发明提供了喹啉或异喹啉类小分子化合物在人多能干细胞培养及冷冻保存中的应用及实施方法，可显著促进人多能干细胞存活和克隆形成，并且保持多能干细胞的未分化状态和多能性。

本发明方法中人多能干细胞包括人胚胎干细胞或者利用生物技术手段获得的人诱导多能干细胞。

人多能干细胞在解离成单细胞传代时存活率极低，本发明的特征之一是通过在解离前后培养基中添加适当浓度的喹啉或异喹啉类小分子化合物，可显著提高解离成单细胞的人多能干细胞的存活和克隆形成。其浓度可以在1-100μM的范围。

人多能干细胞以单细胞形式进行冻存，复苏后细胞存活率极低，本发明的特征之一是通过在冻存液、复苏液或者培养基中添加适当浓度的喹啉或异喹啉类小分子化合物，可显著提高冷冻保存的人多能干细胞存活和克隆形成。其浓度可以在1-100μM的范围。