[发明专利]一株用于生产固定化碱性果胶酶纳米微球的工程菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.重组大肠杆菌E.coli BL21λ(DE3)pABC-PGL，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心，菌种保藏号为CGMCC NO.10911；所述重组大肠杆菌是一种能够生产碱性果胶酶固定化纳米微球的重组菌株。

2.权利要求1所述的重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将PHA前体合成酶基因phaAB、碱性果胶酶基因pgl和连接肽linker的融合基因pgl-linker以及PHA合成酶基因phaC依次插入表达质粒pCDFDuet-1中，构建得到重组质粒pABC-PGL；

具体操作包括如下步骤：

1)利用PCR扩增得到PHA前体合成酶基因phaAB，然后采用限制性内切酶切割载体质粒pCDFDuet-1和PHA前体合成酶基因phaAB，再将PHA前体合成酶基因phaAB插入载体质粒pCDFDuet-1中，得到载体质粒pAB；

2)采用限制性内切酶切割载体质粒pAB和基因pgl-linker，然后将基因pgl-linker插入质粒pAB中，得到载体质粒pAB-PGL；

3)利用PCR扩增得到phaC基因，然后采用限制性内切酶切割载体质粒pAB-PGL和基因phaC，将基因phaC插入载体质粒pAB-PGL中，得到重组质粒pABC-PGL；

(2)将重组质粒pABC-PGL转化大肠杆菌E.coli BL21λ(DE3)，得到重组大肠杆菌菌株E.coli BL21λ(DE3)pABC-PGL。

3.根据权利要求2所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，碱性果胶酶基因pgl选自枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。

4.根据权利要求2所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，PHA合成酶基因phaC来源于Ralstonia eutropha。

5.根据权利要求2所述重组大肠杆菌的构建方法，其特征在于，所述碱性果胶酶基因pgl和连接肽linker的融合基因pgl-linker的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；PHA合成酶基因phaC的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

6.基于权利要求1所述的重组大肠杆菌固定化生产碱性果胶酶纳米微球的方法，其特征在于：将重组大肠杆菌E.coli BL21λ(DE3)pABC-PGL菌株在矿物质培养基中进行诱导表达培养后，再经分离提纯，获得碱性果胶酶纳米微球。

7.根据权利要求6所述的固定化生产碱性果胶酶纳米微球的方法，其特征在于：所述将重组大肠杆菌E.coli BL21λ(DE3)pABC-PGL菌株在矿物质培养基中进行诱导表达培养，具体操作为：

首先，将重组大肠杆菌E.coli BL21λ(DE3)pABC-PGL菌株在LB培养基中过夜培养作为种子液，再按2％的接种量将种子液接入装有100mL MM培养基的500mL三角瓶中，其中MM培养基另加入1g/L的葡萄糖、100mg/L的Streptomycin和0.2g/L的IPTG，30℃、200rpm/min的条件下培养48小时；

其中0.5g/L的葡萄糖、Streptomycin及IPTG在培养开始时加入，另0.5g/L的葡萄糖在培养24小时后加入。

8.根据权利要求6所述的固定化生产碱性果胶酶纳米微球的方法，其特征在于：所述分离提纯的具体操作为：

收集发酵液，离心，弃上清；用10mM磷酸缓冲液对菌泥进行充分洗涤，再将菌泥重悬于10mM磷酸缓冲液中；然后，超声破壁处理20分钟；通过甘油密度梯度离心的方法从菌体细胞裂解液中纯化微球，并用50mM磷酸缓冲液对纯化的微球进行充分洗涤，去除甘油残留；最后经冷冻干燥得到碱性果胶酶固定化纳米微球固体粉末。