[发明专利]基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法

权利要求书

1.一种用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，包括以下步骤：

步骤1)将电极浸入含0.1μM的第一DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应6小时，随后将电极浸入含0.1M的巯基己醇的溶液中，在37℃下反应1小时；其中，所述第一DNA片段分子含有至少一个巯基和一个氨基；

步骤2)将经步骤1)修饰后的电极浸入含饱和银纳米颗粒的溶液中，在37℃下反应1小时，随后将电极浸入含1μM的第二DNA片段分子的溶液中，在37℃下反应0.5小时；其中，所述第二DNA片段分子能够与所述第一DNA片段分子进行碱基互补配对；

步骤3)分别配制至少四种不同浓度的microRNA标准液；

步骤4)将经步骤1)和2)修饰后的电极浸入microRNA标准液中，加入1μM的第三DNA片段分子、5单位的Klenow片段和5nmol的dNTPs，在37℃下反应1小时；所述第二DNA片段分子能够与游离态的microRNA发生反应形成杂交体，所述第三DNA片段分子能够通过链置换反应将microRNA从该杂交体中再次解离出来，使microRNA回到游离态，起始新一轮的杂交与链置换反应；

步骤5)将经步骤4)反应后的电极浸入100μL浓度为0.5unit/μL的Nt.BbvCI溶液中，在37℃下反应1小时；

步骤6)取出经步骤5)反应后的电极，将其作为工作电极，以Ag/AgCl为参比电极、铂丝电极为对电极、0.1M的氯化钾溶液为电解液，采用线性扫描伏安法进行检测，将得到的电信号与microRNA标准液的浓度关系绘制成标准曲线图；

步骤7)将经步骤1)和2)修饰后的电极浸入待测液中，按步骤4)～6)的方法得到待测液的电信号，通过与标准曲线图进行比对，得到待测液中microRNA的浓度。

2.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，所述线性扫描伏安法的扫速为100mV/s。

3.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，所述microRNA标准液的浓度不超过10nM。

4.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，在步骤1)开始前，对电极进行预处理，具体包括：将电极浸泡在水虎鱼溶液中5分钟，所述水虎鱼溶液的配方为98％硫酸：30％双氧水＝3:1；使用5000目砂纸分别与粒径为1μm、0.3μm、0.05μm大小的氧化铝浆对电极进行打磨，随后将电极放入乙醇中超声5分钟，再放入纯水中超声5分钟，随后将电极放入50％硝酸中浸泡30分钟，最后在0.5M硫酸中进行清洗。

5.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，所述电极为金电极。

6.如权利要求1所述的用于非疾病诊断目的的基于恒温反应的针对待测液中microRNA的检测方法，其特征在于，所述银纳米颗粒通过以下方法制得：配制含0.25mM硝酸银与0.25mM柠檬酸三钠的混合溶液，配制10mM的硼氢化钠溶液，将100mL混合溶液与3mL硼氢化钠溶液混合，并剧烈搅拌30分钟；静置过夜后，通过离心得到银纳米颗粒。