[发明专利]能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用

说明书

本发明提供一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒，该质粒含有四个shRNA表达基因，能同时编码四种分别靶向流感病毒PA、PB1、PB2、NP基因保守区域的特异shRNA。该质粒适用于多种转基因技术。使用慢病毒载体将该质粒转入体外培育的MDCK细胞后，经攻毒实验证明，筛选得到的转基因细胞系具有抵抗不同亚型流感病毒感染的能力。将该质粒通过静脉与肌肉注射入4周龄仔猪，然后用H3N2亚型猪流感病毒感染，发现经血液注射组具有更强的抑制流感病毒的复制。为RNAi应用于猪流感病毒的研究以及猪流感的防治积累了必要的实验数据，为转基因猪抗流感研究奠定基础。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，具体地说，涉及一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用。

背景技术

猪流感(Swine Influenza，SI)是由正粘病毒科、流感病毒属、A型流感病毒(Influenza A virus，IAV)引起的一种急性、高度接触传染的呼吸道疾病，临床症状表现为，发热、咳嗽、流鼻涕，结膜炎、厌食及精神不振等。猪流感病毒(Swine Influenza Virus，SIV)能在猪上呼吸道上皮细胞内复制，造成猪感染，致使猪体免疫系统稳态发生变化，导致细菌、支原体和其他病毒的继发或混合感染，使疫情加重，病猪死亡率上升，给养猪业带来极大经济损失。越来越多的资料表明，猪作为流感病毒的“混合器”，在流感病毒跨种属障碍感染新宿主的过程中，起着重要的作用。猪上皮细胞具有唾液酸α-2,6半乳糖苷和唾液酸α-2,3半乳糖苷，人流感病毒可与前者结合，而禽流感病毒与后者结合，由此决定了能够同时被人流感病毒和禽流感病毒感染，使其成为IAV发生基因重组或重排的主要场所。猪流感HA受体结合位点具有与两种流感病毒受体相同的结合特异性，是SIV不仅可感染猪，同时也具有感染禽和人类的能力。因此，猪流感除了具有兽医公共卫生意义外，还具有深远的人类公共卫生意义。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指RNA对基因表达的调控，由dsRNA(double-strand RNA)或siRNA(small interfering RNA，siRNA)引发的对同源性mRNA降解的现象。它最大优点在于具有高度的有效性和特异性，且具有快速的预防与治疗效果。它的作用在基因功能研究和病毒性疾病的治疗领域有非常广阔的前景，例如在抗艾滋病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒病的研究中都发现，RNAi对于抑制这些病毒的复制具有较好的效果，可能是这类病毒病治疗的有效途径。

A型流感病毒(IAV)属于正粘病毒科，是单股负链RNA病毒，以变异速度快、感染致病性强、传播速度快成为造成人、哺乳动物和禽类流感大流行的主要病毒。目前抗病毒药物和疫苗免疫存在局限性，使病毒对药物产生耐受性，迫于选择压力病毒会快速发生变异以逃避药物或疫苗免疫；研究人员选择RNAi方法抑制流感病毒的复制通常针对流感病毒基因的保守序列作为靶序列，由于干扰序列的高度转移性，使RNAi技术在流感病毒防治的应用中也遇到了技术屏障。因此，亟需开发一种基于RNAi技术的抗病毒治疗新方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种能抑制猪流感病毒的shRNA转基因重组质粒及其应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种能抑制猪流感病毒复制与感染的shRNA，所述shRNA是以猪流感病毒PB2，以及任选PA、PB1、NP中的至少两种为靶基因，编码所述shRNA的核苷酸序列为(如SEQ ID No.1-8所示的核苷酸序列)：

具体的，在本发明的一种实施方式中，shRNA以猪流感病毒PB2、PA、PB1和NP为靶基因；

在本发明的一种实施方式中，shRNA以猪流感病毒PB2、PA和PB1为靶基因；

在本发明的一种实施方式中，shRNA以猪流感病毒PB2、PA和NP为靶基因；