[发明专利]一种铅-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及检测领域，更具体地说，涉及一种铅-血红蛋白螯合物及其制备方法和应用。

背景技术

血红蛋白(hemoglobin；HB；HGB)是高等生物体内负责运载氧的一种蛋白质。是使血液呈红色的蛋白。人类红细胞内有三种正常血红蛋白即Hb-A、A₂及F。Hb-A是正常成人红细胞内血红蛋白之主要成分，Hb-A₂是次要成分约占2％,而Hb-F在正常成人或儿童之红细胞中占2-3％以下，Hb-F在胚胎十月开始产生为胎儿红细胞之主要成分，足月新生儿的红细胞中Hb-F占70-80％,其余为Hb-A，二个月后占50％，四个月后少于10％，六个月后大部消失。血红蛋白除运输氧气二氧化碳，还可以导致血管痉挛和血管收缩。在体内存在的三种形式的血红蛋白，氧合血红蛋白、还原型血红蛋白及高铁血红蛋白，其中氧合血红蛋白缩血管能力最强，而高铁血红蛋白几乎没有收缩血管活性。

铅(Pb)是一种常见的有毒金属及环境污染物，广泛应用于工业生产环境中，包括冶炼锻造、铅电池生产、汽油添加剂的生产过滤中等，与人们生活息息相关。对于普通人群，主要是通过吸入铅污染的空气，或饮用以铅壶或铅锡壶盛装的酒，甚至使用或滥用含铅的药物治疗慢性疾病而摄入铅。越来越多的研究证明铅可以对机体造成急性、慢性损伤，甚至导致癌症的发生。美国毒物与疾病登记署公布研究表明，铅是一种全身性毒物，可以影响神经、造血、内分泌、免疫、生殖、肝脏、肾脏等组织器官，国际肿瘤研究机构(IARC)也将铅及其化合物列为第2B类人致癌物。可见铅对机体的影响及其重要，不可忽视。

铅与多种蛋白质之间关系密切，可以与多种蛋白质结合，抑制多种蛋白酶的活性。随着对铅毒性研究的深入，人们逐渐认识到铅与蛋白的相互作用在其致毒过程中扮演着重要的角色，被认为是了解铅的毒性机理的关键所在，因此，对铅和蛋白质相互作用的研究就显得愈发重要。而现在关于铅与蛋白质作用的机理仅是冰山一角，还有很多蛋白质与铅之间的关系还不清楚，因而加强对于铅与蛋白质之间的关系至关重要。

发明内容

针对铅污染严重的问题，本发明的目的在于提供一种铅-血红蛋白螯合物及其制备方法，并建立铅-血红蛋白螯合物的定性、定量检测方法，以便定量检测铅-血红蛋白螯合物在评价一个地区铅污染程度的应用。通过定量检测一个地区人群血清中铅-血红蛋白螯合物可以间接反映这个地区人群受铅污染的情况，从而间接反映这个地区铅污染程度。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：提供一种铅-血红蛋白螯合物，铅离子与血红蛋白通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成。

本发明还提供一种上述的铅-血红蛋白螯合物的制备方法，包括以下步骤：

A)铅与血红蛋白的螯合反应：在提纯源于人体的血红蛋白或按照生物学方法重组的血红蛋白中加入铅离子进行螯合反应，得到反应溶液；

B)纯化铅-血红蛋白螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的血红蛋白以及多余的铅离子，即得铅-血红蛋白螯合物。

其中，体外合成法中所述步骤B)具体如下：

(1)溶解样品：向经过步骤A)得到的反应溶液中加入生理盐水使铅-血红蛋白螯合物复溶；

(2)平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与血红蛋白特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；

(3)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(1)中样品，然后上柱，血红蛋白与填料特异性结合；

(4)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅰ；

(5)收集：收集洗脱液Ⅰ；

(6)透析：将步骤(5)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH₂O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；

(7)平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与铅特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；

(8)上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤(6)中样本，然后上柱；

(9)洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱，得到洗脱液Ⅱ；

(10)收集：收集洗脱液Ⅱ；

(11)透析：将步骤(10)中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH₂O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得铅-血红蛋白螯合物。