[发明专利]一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法。

背景技术：

角膜位于眼球最外层，受伤概率极高，易导致不同程度的瘢痕，影响视力，角膜损伤种类繁多，其中化学损伤在临床上治疗难度较大，由于化学物质能对眼组织结构造成严重损伤，导致上皮坏死、脱落，角结膜融解穿孔及睑球粘连等，预后较差；目前临床上主要以羊膜移植或角膜移植来治疗，但前者常常发生羊膜自溶，后者又面临供体缺乏和免疫排斥两大问题，所以角膜缘干细胞移植治疗角膜损伤成为研究的热点。角膜碱烧伤后，由于碱的皂化作用，首先破坏角膜的最外层—上皮层，上皮损伤后角膜缘干细胞向中央移行，形成覆盖创面的新上皮。一旦角膜缘损伤，角膜上皮再生来源缺乏，就会严重延迟角膜上皮的修复，从而激发急性炎症反应；白细胞迅速侵入角膜，缺损区出现多形核白细胞(PMN)，PMN释放大量的蛋白酶；其中的胶原酶溶解胶原纤维，而被激活的基质金属蛋白酶(MMPs)降解角膜细胞外基质多种成分，致使角膜组织迅速崩解，形成溃疡；同时，暴露的角膜基质细胞受刺激后，为了弥补溃疡面的缺损，从静止状态向修复表型的成纤维细胞、肌成纤维细胞转化，使得细胞内部结构发生改变，光线通过时发生散射而致透明度下降；而且成肌纤维细胞会产生大量的粗大且排列紊乱的胶原纤维，造成组织纤维化瘢痕的形成，严重影响视力的恢复。所以，角膜严重损伤治疗必须从两方面着手，一是进行角膜缘干细胞移植，为角膜上皮及时修复提供种子细胞；二是防止角膜基质细胞向肌成纤维细胞转化，抑制瘢痕的形成。近年来，为了解决角膜缺损后的干细胞来源问题，研究者尝试在体外培养自体或同种异体培养角膜缘干细胞(LSCs)用于角膜移植；体外培养的角膜缘干细胞具有诸多优点：1、所需角膜缘组织极少，对供眼无潜在威胁；2、培养的细胞可冻存用于二次移植；3、能抑制眼表急性病变的发展，迅速恢复术眼正常的眼表结构；4、可避免异体组织移植而导致的免疫排斥；5、缓解角膜供体来源不足的难题。但角膜缘干细胞移植必须借助一种安全可靠的载体，这是决定该技术应用效果的关键环节，若载体适宜，角膜缘干细胞移植将为角膜损伤患者带来新的福音；目前，临床上应用较多的载体是羊膜，因其作为一种基底膜，具有类似角、结膜的成分，即Ⅳ型胶原纤维，但严重角膜损伤如碱烧伤后，组织中胶原酶的表达量大大增加，易导致羊膜自溶，直接延缓修复过程；因此患者即使多次移植，效果仍不理想，探寻一种安全有效的角膜缘干细胞移植载体成为当前研究的热点。

在现有技术中，水溶性的羟乙基壳聚糖(HECTS)是壳聚糖的一种重要衍生物，其在生物体内可被生物酶催化，缓慢降解成对人体无毒的单糖，与细胞外基质成分相似，支持细胞的粘附和生长；同时能够抑制成纤维细胞生长，降低创面转化生长因子-β(TGF-β)表达水平，从而具有防粘连的作用；海藻酸钠(SA)是从海藻中提取的天然聚阴离子多糖，具有良好的成胶性、生物相容性和低毒性以及相对低廉的价格，被广泛地应用在轻工业、食品、组织工程和医药等领域，SA具有聚阴离子羧基，可与二价离子形成离子交联型水凝胶，常用作酶类、蛋白质、药物及动植物细胞的包埋固定化载体，但由于二价离子很容易与周围介质中的离子发生交换，导致凝胶的降解速度不可控。

发明内容：

本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求设计一种羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备方法，以角膜碱烧伤为研究模型，针对角膜损伤修复制备能够在角膜损伤原位自主交联快速形成凝胶的新型角膜缘干细胞移植载体。

为了实现上述目的，本发明涉及的羟乙基壳聚糖原位水凝胶的制备工艺包括高碘酸钠水溶液制备、氧化海藻酸钠制备和羟乙基壳聚糖原位水凝胶制备三个步骤：

(1)、高碘酸钠水溶液制备：常温下称取高碘酸钠(sigma，S1878)粉末1g并溶于50ml去离子水中，制得质量百分比浓度为2％的高碘酸钠水溶液；

(2)、氧化海藻酸钠制备：在质量百分比浓度为2％的海藻酸钠水溶液中按海藻酸钠与高碘酸钠反应的摩尔比为10:1加入步骤(1)制备的高碘酸钠水溶液，在室温下搅拌海藻酸钠水溶液和高碘酸钠水溶液混合形成的混合液使其进行氧化反应，24h后在混合液中加入乙二醇100ul终止氧化反应0.5h，抽滤混合液并用无水乙醇脱水沉淀得到白色固形物，低温真空干燥白色固形物后制得氧化海藻酸钠粗品，再将氧化海藻酸钠粗品用蒸馏水溶解成质量百分比浓度为2％的氧化海藻酸钠粗品水溶液，在4℃温度下将氧化海藻酸钠粗品水溶液置于透析袋中透析，每6h换1次蒸馏水，用电导率仪测定氧化海藻酸钠粗品水溶液透析完全后进行离心后取上清液冷冻干燥制得氧化度为10％的氧化海藻酸钠；