[发明专利]一种镉-IgM螯合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种镉-IgM螯合物，其特征在于，镉离子与IgM通过巯基或/和半胱氨酸残基螯合而成；镉-IgM螯合物的制备方法，包括以下步骤：

A）镉与IgM的螯合反应：在人源的的IgM或按照生物学方法重组的IgM中加入镉离子进行螯合反应，得到反应溶液；

所述步骤A）具体如下：

1）透析袋的处理：将透析袋放入500mL体积的5mmol/L EDTA+200mmol/L NaHCO₃溶液中，煮沸10min；倾弃EDTA/NaHCO₃液，用超纯水轻轻漂洗，再用500mL 5mmol/L EDTA煮沸10min；弃掉煮沸液，彻底用超纯水清洗，加入大量的超纯水浸泡透析袋4℃过夜；使用时，戴上手套，取出透析袋，用大量的超纯水彻底冲洗其内外表面；

2）取2.0mg ITCBE溶于2mL DMSO中；

3）取4.0mg IgM溶于4.0mL 0.01M pH9.0的硼酸盐缓冲溶液中；

4）缓慢将步骤2制备的液体加入IgM溶液中，边滴加边震荡，于25℃，100r/min的摇床中作用24h，然后用透析袋透析24h，除去未与IgM结合的ITCBE；

5）将透析所得的液体用1mol/L HCl调节pH值至7.0，然后缓慢逐渐滴加80μl 1mmol/L镉离子溶液，边滴加边振荡，以免镉离子使蛋白变性沉淀；

6）将加好的溶液在25℃，100r/min的摇床中反应2h，用处理好的透析袋进行透析24h；

7）将透析后的液体于-20℃分装保存；

B）纯化镉-IgM螯合物的提取：采用免疫亲和层析法，去除反应溶液中未反应的IgM以及多余的镉离子，即得镉-IgM螯合物；

所述步骤B）具体如下：

（1）溶解样品：向经过步骤A）得到的反应溶液中加入生理盐水，使镉-IgM螯合物复溶；

（2）平衡层析柱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱的管路，在层析柱中装入能与IgM特异性结合的填料，装柱后，继续使用稀释缓冲液平衡层析柱；

（3）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（1）中样品，然后上柱，IgM与填料特异性结合；

（4）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.05-0.1mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱；

（5）收集：收集经过步骤（4）洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；

（6）透析：将步骤（5）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH₂O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本；

（7）平衡层析柱：采用新的层析柱，用稀释缓冲液冲洗管路，在该层析柱中装入能与镉特异性结合的填料，装柱后再用稀释缓冲液平衡层析柱；

（8）上样：待层析柱平衡后，用稀释缓冲液稀释步骤（6）中样本，然后上柱；

（9）洗脱：使用稀释缓冲液冲洗层析柱至基线平衡，然后使用0.5-1.0mol/L的磷酸盐溶液进行洗脱；

（10）收集：收集经过步骤（9）洗脱后的洗脱液，收集完毕后立即使蛋白复性；

（11）透析：将步骤（10）中的收集的洗脱液，装透析袋，用ddH₂O透析除盐，换水三次后，4℃透析过夜，收集样本，即得镉-IgM螯合物。

2.根据权利要求1所述的镉-IgM螯合物，其特征在于，还包括步骤C）：对镉-IgM螯合物的鉴定；

其中，步骤C）中具体如下：

（1）制备胶床：以琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶中的一种作为介质制备胶床；

（2）加样：取步骤B）中提取纯化得到的镉-IgM螯合物，加入稀释缓冲液，并混匀，然后加样于样品槽中；

（3）电泳：连接电泳板，进行电泳；

（4）检测：在胶床上找出含镉的蛋白条带，将该蛋白条带取出，将蛋白条带复溶，然后再采用ICP-MS法、AAS法或ELISA法检测是否含有镉以及检测镉的含量。

3.一种根据权利要求1所述的镉-IgM螯合物在制备检测血样中镉-IgM螯合物的试剂或试剂盒中的应用。

4.一种至少包括根据权利要求1所述的镉-IgM螯合物作为标准品的试剂盒。