[发明专利]用EMS诱导‘Hort16A’后代优株变异及AFLP检测方法

说明书

技术领域

本发明属于植物育种及鉴定方法，特别是猕猴桃育种及鉴定方法。

背景技术

猕猴桃(kiwifruit) ，属猕猴科猕猴桃属(Actinidiacea，Actinidia spp.)，为多年生落叶藤本植物，雌雄异株。猕猴桃是人工驯化栽培野生果树的树种，通过人为诱导猕猴桃变异突变可以产生自然界原来没有的或常规方法难以获得的新风味或新性状的品种。但对于EMS处理猕猴桃变异育种的研究的报道较少。文献1（龙自立，猕猴桃离体再生与变异诱导的研究[D]. :浙江大学，2008.）是用EMS处理猕猴桃愈伤组织诱导其不定梢变异；文献2（周立名、 王飞、王佳，EMS 诱变处理定向筛选猕猴桃耐盐突变体研究 [J]. 西北农业学报,2009, 18(5):330-335.）是用EMS对海沃德和红阳猕猴桃叶片进行处理，筛选其耐盐突变体。但两者都是单独用EMS对愈伤组织浸泡较长时间后，再移入培养基对猕猴桃进行诱导，所需时间较长。

绝大部分情况下，变异是不定向的，对变异的植株进行检测，有助于了解变异性状。AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism) 即扩增片段的长度多志性标记是一种基于DNA多态性的分子标记技术，具有DNA用样量少，多态性检测灵敏度高，稳定性好、谱带丰富等特点。但由于PCR扩增所需酶用量、酶切时间与酶的活性相关，有必要研究这些因素对酶切结果的影响；又由于连接引物需要酶的活性和能量，因此，分析其因素对连接效果的影响也是必要的。而且，AFLP引物包括5′端的与人工接头序列互补的核心序列CORE、限制性内切酶特定序列ENZ和3′端的带有选择性碱基的粘性末段EXT三部分，选择性扩增引物是指3′端的带有特定选择性碱基的粘性末段的引物。选择性扩增体系是AFLP预扩增体系之后的重要步骤，在该体系中，筛选适当的引物组合，可以方便随机扩增多态性DNA和提高反映其片断长度多态性的可靠性，达到一次鉴定检测出诱导产生的突变体DNA水平上的微小差异的目的。

发明内容

本发明旨在以中华猕猴桃 ‘hort16A’后代优株为材料，对猕猴桃进行EMS诱变处理，并通过改善AFLP体系对诱变处理后的猕猴桃DNA性状进行研究和分析，提供适合猕猴桃DNA多态性的分子标记的检测方法。

一、用EMS诱导‘Hort 16A’后代优株变异的方法

包括以下步骤：

（1）诱变剂培养基的配制

猕猴桃诱变剂培养基为：MS+（0.01～0.09mg/L）EMS+0.3mg/L ZT+0.05g/L NAA+30g/L Sucrose+5g/L Agar，以上EMS过滤灭菌加入，调pH至5.8，以该愈伤组织培养基作为诱变剂培养基；

（2）诱变处理

取无菌猕猴桃叶片，沿脉切成块状接种于诱变剂培养基上，24～26℃、避光培养1个月，待不定芽分化后，接种于不定芽增殖培养基：MS+1.5mg/L ZT+0.08mg/L EMS + 30g/L Sucrose+5g/L Agar，24～26℃，光照强度3000～5000 lx，光周期16 h /d条件培养；

待芽逐渐长大形成苗，将苗接种于生根培养基：1/2MS+0.7mg/L IBA+0.5g/L AC+30g/L Sucrose+5g/L Agar，24～26℃，光照强度3000～5000 lx，光周期16 h /d条件培养。

所述的用EMS诱导‘Hort 16A’后代优株变异的方法中，步骤（1）诱变剂培养基的EMS浓度为0.08mg/L。

二、用EMS诱导‘Hort 16A’后代优株变异的AFLP检测方法

包括以下步骤：

（1）猕猴桃总DNA的提取及电泳检测：

提取猕猴桃DNA，取DNA溶液5μL用1.0%琼脂糖凝胶电泳后检测DNA的纯度及浓度；

（2）猕猴桃AFLP酶切反应中，采用20μl体系：

300ng DNA，

1 U EcoRI/MseI，

4μl Buffer，

其余为ddH₂O；

反应程序为37℃酶切4 h；65℃，20min；4℃，保存；

（3）在猕猴桃AFLP连接反应中，采用20ul反应体系：

5μl DNA酶切产物，

2μl T4 buffer，

2 U T4 DNA连接酶，

1μl 接头引物，引物浓度为100nM，