[发明专利]一种分离纯化无机焦磷酸酶的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分离纯化无机焦磷酸酶的方法。

背景技术

无机焦磷酸酶是以焦磷酸为底物的水解酶，该酶广泛存在于自然界，参与合成糖类、核酸和蛋白质等多种代谢途径中所形成的焦磷酸的水解。许多利用ATP的代谢活动会产生焦磷酸，无机焦磷酸酶能将生物体代谢活动中产生的焦磷酸降解掉，防止其过度积累。IPPA不仅在生物体内发挥作用，防止无机焦磷酸影响生物体的正常代谢，近年来随着生物催化剂的兴起，其体外功能也逐渐显现出来。

无机焦磷酸酶是催化焦磷酸水解为正磷酸的一类酶。焦磷酸是某些代谢过程如DNA和RNA聚合、氨基酸活化氨酰tRNA合成、脂肪酸的β-氧化脂酰辅酶A的合成、纤维素合成UDP-葡萄糖的合成和淀粉合成ADP-葡萄糖的合成过程的副产物。无机焦磷酸酶通过分解焦磷酸可使上述反应向合成方向进行并能为许多生物合成反应提供能量，因而无机焦磷酸酶是生命所必需的。

基因组测序是当代生命科学技术的前沿核心技术之一，其中的焦磷酸测序法采用了荧光素酶进行检测，读长大，精确度高。现有的荧光素酶纯化技术中，得到的产物纯度较低，容易影响测序反应的精度，不能满足基因组测序的需要。

发明内容

本发明的一个目的是一种分离纯化无机焦磷酸酶的方法，包括以下步骤：

（1）调整pH值：调节粗酶液的pH值至8.0-9.0；

（2）加入金属盐：加入镁盐和钙盐；

（3）加入稳定剂；

（4）有机溶剂沉淀；

（5）无菌过滤；

（6）进行镍柱纯化；

（7）采用superdex 200进行分子排阻。

所述镁盐为硫酸镁、氯化镁和硝酸镁中的一种或几种，所述钙盐为硫酸钙、氯化钙和硝酸钾中的一种或几种。

所述步骤（2）中加入镁盐和钙盐，使镁离子的终浓度为20-30mmol/l，钙离子的终浓度为10-20mmol/l。

所述稳定剂为甘油、乙二醇、大豆多糖和二巯基苏糖醇中的一种或几种，优选为大豆多糖和二巯基苏糖醇，稳定剂的终浓度为5-15g/L。

所述有机溶剂沉淀使用的有机溶剂为甲醇、乙腈和丙酮中的一种或几种。

所述无菌过滤使用0.22μm滤膜。

所述纯化方法的步骤中，保持无机焦磷酸酶的环境温度为16℃以下。

所述无机焦磷酸酶带有His-tag。

所述镍柱纯化时，使用20-500mM的咪唑进行梯度洗脱。

所述superdex 200为GE分子排阻预装柱。

在进行镍柱纯化和superdex 200分子排阻时，使用pH8.5的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡和洗脱。

本发明中加入的镁盐和钙盐能够增加无机焦磷酸酶的稳定性，同时保持其在纯化过程中的高活性。稳定剂的加入进一步确保了无机焦磷酸酶的活性在纯化过程中不受损失。DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析柱、superdex 200分子排阻和有机溶剂沉淀相结合，能够有效去除酶液中的杂蛋白和其他杂质分子。使用本方法纯化得到的萤火虫无机焦磷酸酶活力大，纯度高，催化效率高，能够确保反应精度，满足基因组测序的需要，适宜广泛应用于基因组测序中。

具体实施方式

实施例1

（1）调整pH值：调节粗酶液的pH值至8.5；

（2）取1L荧光素酶粗酶液，加入氯化铵2mmol、氯化钾3mmol、氯化镁10mmol、硫酸镁15mmol和氯化钙16mmol；

（3）加入大豆多糖6g和二巯基苏糖醇3g；

（4）有机溶剂沉淀：缓慢加入15ml丙酮和20ml乙腈，搅拌，静置10分钟，13000rpm离心，弃去上清，加入10ml Tris-HCl缓冲液，搅拌，13000rpm离心，收集上清液；

（5）使用0.22μm滤膜进行无菌过滤；

（6）进行镍柱纯化，使用pH8.5的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡和洗脱，洗脱时使用20-500mM的咪唑进行梯度洗脱；

（7）采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，使用pH8.5的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡和洗脱，得到酶液100ml，旋转蒸发干燥；

以上步骤均在16℃环境下进行。

实施例2

（1）调整pH值：调节粗酶液的pH值至8.0；