[发明专利]豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法，专用于豇豆疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于田间豇豆疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。

背景技术

由豇豆疫霉菌（Phytophthora vignae Purss）侵染引起的豇豆疫病是豇豆生产上不容忽视的主要病害之一，该病害俗称“死藤”，流行性强，年度间病情差异大，常常造成豇豆植株大面积的枯死，并日趋危害严重，平均发病率为3-11%，严重田块发病率高达65%，甚至告成绝收，极大地影响了豇豆的产量和质量。豇豆疫霉菌主要以厚垣孢子、卵孢子及病残体在土壤中越冬，在适宜的环境条件下，越冬体产生游动孢子，借土壤、灌溉水和风雨等传播到寄主表面，产生芽管侵入，继而在其受害部位再产生孢子囊进行再侵染，尤其在潮湿、多雨条件下，该病害传播与蔓延迅速，常造成豇豆植株大面积死亡。豇豆疫霉菌侵染部位主要为植株根部和近土表茎部，侵染点带有一定的隐蔽性，在发病前期如果未能准确地对病原菌进行检测和鉴定，一旦病害显症发生就很难控制。豇豆疫病还常与豇豆其它病害（如枯萎病、蔓枯病）混合发生，而且发病症状具一定的相似性，常给病害的正确诊断造成极大的困难，在生产中常因病害诊断不准确，未能达到实施“对症下药”的正确防治措施而致使病害造成惨重损失的现象时有发生。因此建立豇豆疫霉菌快速检测体系，在发病前期对植株及土壤是否携带豇豆疫霉菌进行快速准确的检测，这对于病害的准确预测预报、制定适时有效的防治措施、控制病害的传播和流行（蔓延）以及减少病害造成的经济损失都具有重要的理论和实际意义。

豇豆疫霉菌传统的检测鉴定主要依据形态学特征、致病性测定、生理生化特性等，这种传统检测鉴定方法不仅程序繁琐、所需时间较长、鉴定时还易受人为及环境等诸多因素的干扰，难以满足病害防治中快速、准确和稳定的检测要求，很容易错过病害防治的最佳时期。

随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的病原菌快速分子检测方法得到了迅猛的发展和应用，PCR技术具有特异性强、灵敏度高、快速且不需要进行病原菌分离培养的特点，可用于病害显症之前的早期诊断、监测。国内外已有研究人员利用核糖体转录间隔区（rDNA – ITS）基因为病原菌检测靶标，开发出了灰霉菌、炭疽菌、枯萎病菌、链格孢等不同病原真菌的特异性检测引物，并利用特异性引物进行PCR扩增，达到病原菌快速、准确的检测和鉴定。豇豆疫霉菌属于疫霉属卵菌，大量研究表明，rDNA – ITS基因序列在疫霉菌不同种间差异很小，以ITS为靶标设计的引物难以将疫霉属中不同种区分开，因此，目前大部分疫霉菌高灵敏性和特异性检测的主要靶标为Ypt1（ras-related protein）基因。

Ypt1基因包含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些内含子在疫霉菌不同种之间具有多变性，该基因可适合作为疫霉菌分子检测靶标。目前尚无针对该靶基因设计的特异性豇豆疫霉菌检测引物和检测方法的报道，因此，可以通过测定豇豆疫霉菌和其它疫霉菌的Ypt1基因，对疫霉菌不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出豇豆疫霉菌特异性引物，达到豇豆疫霉菌的快速检测和鉴定。

发明内容

本发明的目的是针对现在技术中对豇豆疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和鉴定的问题，提供了一种豇豆疫霉菌PCR检测引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测引物和检测方法检测豇豆疫霉菌准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、快速且结果可靠。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1. 通过测定豇豆疫霉菌和其它疫霉菌的Ypt1基因，对疫霉菌不同种间Ypt1基因序列进行比对分析，设计出对豇豆疫霉菌具有特异性扩增作用的1对引物，即特异PCR检测引物的序列为：

上游引物PVF：5^，- CTCAGAATGGCCAAGGTTTC-3^，，

下游引物PVR：5^，- CGTTCCGCGAGACTTT TCTA-3^，；

对豇豆疫霉菌特异性扩增出375bp的产物。

2.豇豆疫霉菌特异分子检测方法的建立

（1）被豇豆疫霉菌侵染（感染）的植物组织DNA的提取.