[发明专利]一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用微生物提高精氨酸产量的方法，尤其涉及一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法。

背景技术

L-精氨酸是一种含有胍基的碱性氨基酸，在哺乳动物中是半必需或条件性必需氨基酸。近年来研究显示，L-Arg能促进各种免疫分子的合成从而可抑制癌细胞的生长，促进尿液循环并降低血液中氨的含量，同时作为生成NO的前体代谢产物，L-Arg还具备放松和扩张血管等重要功能。因此，L-Arg在医药和食品方面有广泛的应用价值，备受国内外研发和生产机构的关注。目前，全世界L-Arg年需求量在15000吨以上，而实际年产量却不到8000吨，生产商主要集中在日本、美国和欧洲等国家，L-Arg在我国还主要依赖进口，是药用氨基酸生产的瓶颈，每年在进口L-Arg这一个产品上的费用达4到5亿元人民币，所以加强L-Arg的生产研究是很有现实意义的。

目前L-精氨酸发酵工程菌株主要集中于棒杆菌属，特别是C.glutamicum和与其DNA序列极其类似的C.crenatum。国内外有关提高精氨酸产量的研究已有很多报道，对其生产菌分子育种策略主要是对其合成途径的疏通、截流、增流等方法。如，Ikeda等通过解除反馈阻遏和反馈抑制的方法对传统的精氨酸产生菌种C.glutamicum A-27、C.glutamicum I-30、C.glutamicum D-77与野生型C.glutamicum的精氨酸操纵子进行测序比对分析，发现这三株菌中分别存在argB26、argB31和argR123等点突变。为探究该突变对C.glutamincum发酵产精氨酸的影响，Ikeda等以不产精氨酸的野生型C.glutamicum为亲本，对其argB的26和31位点分别或组合突变并与argR的致死突变结合，结果发现argB26、argB31两个位点发生点突变且负调控蛋白ArgR缺失时，其精氨酸产量发生了零的突破，达到8.76g/L。Xu等通过PCR方法获得了与精氨酸合成相关的基因簇argCJBDF-argGH，并将其克隆至穿梭表达质粒pJC1，再导入C.crenatum SYPA5-5，利用该基因簇自身的启动子实现了argCJBDF-argGH在C.crenatum SYPA 5-5体内表达上调，其产精氨酸能力较亲本提高了24.9％。三羧酸循环代谢支路生成的谷氨酸不仅是精氨酸合成的前体，而且还是脯氨酸合成的前体，脯氨酸与精氨酸的合成形成竞争关系。因此，切断脯氨酸合成支路有利于细菌体内代谢流向精氨酸合成方向。李小曼等运用同源重组技术构建了一株缺失了γ-谷氨酰激酶编码基因(proB)的工程菌C.crenatum 8-193，该菌种体内γ-谷氨酰激酶活性严重下降，精氨酸产量却能达到13.78g/L，较出发菌株提高了13.6％。

但目前未见敲除dtsR1基因、在对数生长初期添加吐温40或吐温80及在发酵培养基中添加吐温80或油酸或二者混合物以提高精氨酸产量的报道。精氨酸的前体物质是谷氨酸，而谷氨酸的前体物质是三羧酸循环的中间代谢产物α-酮戊二酸，α-酮戊二酸可在α-酮戊二酸脱氢酶复合物(oxoglutarate dehydrogenase complex，ODHC)进一步循环为琥珀酰辅酶A，而ODHC的编码基因sucB、odhA和lpdA受dtsR1基因的正调控。当敲除dtsR1基因，sucB、odhA和lpdA基因的转录水平大幅下降，这有利于α-酮戊二酸流向谷氨酸并进一步流向精氨酸；同时，发现添加Tween 40不仅有利于降低sucB、odhA和lpdA基因的转录水平，而且提高了合成NADPH的磷酸戊糖途径相关基因(如zwf基因)的表达水平，且通过NADPH及NAD/NADPH比值的测定，证实NADPH的供应得到了大幅提高，而1mol精氨酸的合成需要消耗3mol NADPH。因此，二者共同促进了精氨酸产量的大幅提高。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用谷氨酸棒杆菌和钝齿棒杆菌提高精氨酸产量的方法。