[发明专利]河八王的一种DNA指纹图谱及其获取方法与专用引物

权利要求书

1.一种获取河八王DNA指纹图谱的方法，包括如下步骤：

步骤S1：提取河八王的基因组DNA；

步骤S2：采用内切酶EcoR I和Mse I对所述河八王的基因组DNA进行酶切，得到酶切产物；

步骤S3：将所述酶切产物连接上接头引物进行扩增，得到连接产物；所述接头引物为SEQ NO：7和SEQ NO：8，SEQ NO：9和SEQ NO：10；

步骤S4：预扩增反应，采用预扩增引物对所述连接产物进行预扩增反应，其中，所述预扩增引物为SEQ NO：11和SEQ NO：12；

步骤S5：选择性扩增反应，采用引物对Narenga 1、引物对Narenga 2和引物对Narenga3进行选择性扩增，得到AFLP扩增产物；

所述Narenga 1是序列表的SEQ NO：1和SEQ NO：2组成的引物对；

所述Narenga 2是序列表的SEQ NO：3和SEQ NO：4组成的引物对；

所述Narenga 3是序列表的SEQ NO：5和SEQ NO：6组成的引物对；

步骤S6：对所述AFLP扩增产物进行毛细管电泳检测扩增产物，分离DNA 标记，显示河八王的DNA指纹图谱。

2.根据权利要求1所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：步骤S4中，所述预扩增反应程序为预变性94℃ 30 s，56℃退火30 s，72℃延伸80 s，循环30次。

3.根据权利要求2所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述预扩增反应体系为：10 ng/µl的DNA 2µl，Pre-ampmix 1 µl，2.5 mM dNTPs 0.5 µl，10 × PCRbuffer 2.5 µl，Taq DNA polymease 0.5 µl，ddH₂O 18.5 µl；

4.根据权利要求1所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：步骤S5中，所述选择性扩增反应程序为预变性94℃ 30 s，65℃退火30 s，72℃延伸80 s，1个循环；然后以每循环复性温度逐级降低 0.7 ℃梯度进行14个循环；最后以94℃变性30 s，55℃退火30s，72℃延伸80 s，循环23次。

5.根据权利要求4所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述选择性扩增反应体系为：预扩增稀释样品2 µl，10 × PCR buffer 2.5 µl，2.5 mM dNTPs 0.5 μl，正向引物10 mM 1 µl，反向引物10 mM 1 µl，Taq DNA polymease 0.5 µl，ddH₂O 17.5 µl。

6.根据权利要求1~5任意一项所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述河八王的基因组DNA来自河八王的任何部位。

7.根据权利要求6所述的获取河八王DNA指纹图谱的方法，其特征在于：所述河八王的基因组DNA来自河八王的叶片。