[发明专利]一种小麦果聚糖代谢酶基因定量检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及小麦茎秆果聚糖代谢酶基因的实时荧光定量PCR技术定量检测技术，属于植物分子生物技术和基因工程领域，具体地说是一种小麦果聚糖代谢酶基因定量检测的方法。

背景技术

果聚糖作为小麦源(叶)库(茎和穗部)间桥梁代谢物质，不仅通过渗透调节来缓冲逆境胁迫对小麦的伤害，同时它也是小麦籽粒灌浆所需重要碳源，尤其是在小麦灌浆期，当干旱胁迫严重破坏小麦正常光合作用时，小麦开花前贮存在茎秆中果聚糖向籽粒转运，可以在一定程度上补偿因干旱造成的小麦籽粒产量损失。

研究表明，蔗糖：果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)和果聚糖外水解酶(FEH)分别是禾本科植物体内控制果聚糖合成和降解的关键酶。其中，6-SFT主要以蔗糖为底物，催化蔗糖分子上的果糖基转移到另一个蔗糖分子果糖基的C6位上，合成6-蔗果三糖，同时还能以寡果聚糖为底物，生成分支型果聚糖。FEH主要通过一种果聚糖不可逆降解反应，从果聚糖的果糖基末端一次解下一个果糖基，直至剩下一个蔗糖分子，释放出来的果糖分子作为底物可以从新合成蔗糖，通过韧皮部装载，长距离运输进入籽粒。在小麦籽粒灌浆期间，干旱、高温等环境因子均能够诱导茎杆中FEH活性的上升，增强果聚糖的降解和输出，从而促进了整个茎秆非结构碳水化合物和果聚糖的动员能力，促进果聚糖降解产物蔗糖向籽粒转运，来补偿籽粒灌浆。因此，有必要针对小麦灌浆期茎秆果聚糖代谢关键酶基因6-SFT和FEH的差异表达建立快速准确的定量检测方法，从而为深入探索干旱调控小麦灌浆期茎秆果聚糖代谢分子生理调控机制奠定良好的技术基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种小麦果聚糖代谢酶基因定量检测的方法，检测小麦灌浆期茎秆果聚糖代谢关键酶基因6-SFT和FEH，该检测方法弥补常规PCR技术的缺陷，能够实时监测扩增反应，具有快速、实时、可靠的优点。

为实现上述目的，本发明所述一种小麦果聚糖代谢酶基因定量检测的方法，实现步骤如下：

(A)材料取样部位与时间：在小麦开花后5～6d剪取茎秆穗下节茎秆，立即放入液氮保存，提取茎秆中总RNA；

所述小麦茎秆总RNA的提取方法如下：

1)将小麦茎秆浸入液氮，快速剪切小麦茎秆呈1～2cm长的碎片，充分混匀碎片，称取小麦组织0.2g茎秆碎片，加入2ml裂解液RZ，用匀浆仪进行匀浆处理；

2)将匀浆样品在18℃放置5min，使得核算蛋白复合物完全分离，4℃12000rpm离心5min，取上清，加入200μl氯仿，盖好管盖，剧烈震荡15sec，室温放置3min；4℃12000rpm离心10min后将水相转移到新管中；

3)在内有水相的新管中缓慢加入0.5倍体积无水乙醇，混匀，将得到溶液和沉淀一起转入吸附柱中，4℃12000rpm离心30s，弃掉收集管中的废液，向吸附柱中加入500μl去蛋白液，4℃12000rpm离心30sec，弃废液；向吸附柱中加入600μl漂洗液，室温静置2min，4℃12000rpm离心30sec，弃废液；重复操作此步骤一次；将吸附柱放入2ml收集管中，4℃12000rpm离心2min，去除残余液体，放在超净工作台上通风片刻，以充分晾干；

4)将吸附柱转入一个新的1.5ml离心管中，加50μlRNase-Free ddH₂O，室温放置2min，4℃12000rpm离心2min，所得产物于-70℃保存待用；

(C)小麦茎秆总RNA质量检测：

1)采用分光光度法检测RNA的质量，要求OD260/OD280的比率在2～2.1；

2)利用1.0％琼脂糖凝胶检测RNA的质量；

(D)引物设计与合成：根据NCBI上注册的小麦果聚糖代谢关键酶基因的cDNA序列，以Actin(GenBank ID：AB181991)作为内参基因，蔗糖:果聚糖-6-果糖基转移酶(6-SFT)和果聚糖外水解酶(FEH)(GenBank ID分别为：AB029887和AJ508387)为目的基因，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物如下，引物交由生物公司合成。

(E)cDNA的合成：采用反转录试剂盒制备cDNA，具体操作方法为：

1)在冰浴的无核酸酶的离心管中加入如下反应混合物：5μg总RNA、2μl引物、2μl Super Pure dNTPs(2.5mM)、补RNase-Free ddH₂O定容至14.5μl；