[发明专利]一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及水产养殖病害防治领域，具体涉及一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法。

背景技术

斑点叉尾鮰(IctalurusPunctatus(Rafinesque)亦称沟鲶(ChannelCatfish)，属于鲶形目(Siluriformes)、鮰科(Ictaluridae)鱼类。具有食性杂、生长快、适应性广、易饲养、易起捕以及肉质上乘等优点，是世界闻名的养殖品种和游钓对象。斑点叉尾鮰含肉率高，而且营养丰富，据测定，含肉率为75.71％；肌肉中粗蛋白占19.42％，脂肪占1.01％，水分占77.58％，灰分占1.12％，碳水化合物占0.87％；肌肉中含有18种氨基酸，占肌肉总量的18.72％，其中人体必需氨基酸占总氨基酸的42.26％。矿物质含量中Fe、Zn的含量较高，而对人体健康有害的物质如Pb、As等的含量很低。因此，斑点叉尾鮰历来深受东南亚各国和港、澳市场的欢迎，是我国外贸出口的重要水产品之一。当前随着斑点叉尾鮰养殖规模的扩大，集约化养殖程度的提高，其病害的危害也越来越大，其危害程度有加剧趋势,其常见病有：水霉病、腐皮病、出血性腐败症、爱德华氏菌病、柱状病、小瓜虫病、鱼波豆虫病等，特别是斑点叉尾鮰爱德华氏菌病传染性强，发病率高、死亡率最高，可造成鱼种、成鱼大量死亡，给养殖户造成较大经济损失。其病原体是爱德华氏菌(Edwardsiellatarda)，是该菌广泛分布于自然界，菌体短杆状，具周鞭毛，有动力，革兰氏染色阴性。当皮肤受伤可使病原菌侵入机体而发病，引起外伤的主要原因有捕捞损伤和寄生虫寄生损伤等。

近几年来，国产、进口的药物对斑点叉尾鮰爱德华氏菌病均无明显疗效或成本太高，效果不明显。只能通过免疫的途径进行预防，而这种疫苗目前在还是空白。

发明内容

本发明提供了一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法，本发明成本低廉，操作方便，可有效提高斑点叉尾鮰免疫力，防治斑点叉尾鮰爱德华氏菌病发生。

本发明是通过下面的技术方案来实现的。

一种斑点叉尾鮰爱德华氏菌病疫苗的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)、提取菌种：从患有明显爱德华氏菌病症状的斑点叉尾鮰肝脏、肾脏、血液、腹水中分离出病原菌爱德华氏菌，立即放入4-8℃的冰箱中保存；

(2)、感染：将分离的病原菌接种于健康的斑点叉尾鮰体内，在室内进行感染试验，每只斑点叉尾鮰接种的病原菌数为1-2×10⁹个，检查是否有毒力，证明确有毒力才用作制疫苗材料；

(3)、取材：取上述斑点叉尾鮰发病组织材料，称重，每克组织材料中加0.85％生理盐水10毫升，用研钵或匀浆器进行匀浆，制成10％浓度的组织悬液，将制得的组织悬液直接置于-30℃～-40℃低温冰箱中保存，或者向制得的组织悬液中按10％加入50％的磷酸缓冲甘油，将其置4-8℃的冰箱中保存。

(4)、悬液制备：将步骤(3)分离出的致病菌爱德华氏菌接种在普通琼脂营养基或肉汤培养基内，培养24-48小时，加入少量生理盐水，用接种环将菌苔刮下，充分振荡，制成细菌分布均匀的悬液；

(5)、扩大培养：取单个菌落在25-30℃条件下培养48-72小时，振荡使培养斜面上的菌落洗下，或用灭菌接种环轻轻刮下，进行灭活处理；

(6)、灭活：将扩大培养结束的爱德华氏菌悬液摇匀，放入60-70℃恒温水浴1.5-2.5小时灭活或32℃恒温水浴中70-73小时灭活，即制成灭活疫苗；

(7)、合成：将灭活后的菌液置于高速离心机中，用3000转/分离心机离心30-40分钟，分离出上清液，向分离出的上清液中添加一定量得青霉素、链霉素和浓度为10％的福尔马林溶液，并摇匀，其中，每10毫升上清液中加入青霉素8000单位、链霉素8000单位，10％浓度的福尔马林溶液0.1毫升；

(8)、稀释：用0.85％的无菌盐水稀释灭活菌液至浓度为5×10⁹cfu/ml；

(9)、分装：将稀释后的灭活菌液，置于4-8℃冰箱中保存备用；

(10)、检验：对上述稀释好的灭活菌液进行无菌、安全及免疫效果三项检验，要求，灭活菌液中没有活菌存在，灭活细菌的安全的系数要达到100％，免疫保护率达到80％以上；

(11)、检验合格后的灭活菌液，继续置于4-8℃冰箱中保存备用。

步骤(7)合成时，每10毫升上清液中加入青霉素8000单位、链霉素8000单位，10％浓度的福尔马林溶液0.1毫升。