[发明专利]抗肿瘤疫苗佐剂、其制备方法和编码核酸以及抗肿瘤疫苗组合物

说明书

技术领域

本发明涉及一种疫苗佐剂，尤其涉及由鞭毛蛋白与热休克蛋白gp96制备的融合蛋白Flagp96疫苗佐剂。另外，本申请还涉及编码融合蛋白Flagp96的核酸以及含有该融合蛋白Flagp96的疫苗组合物。

背景技术

恶性肿瘤是严重威胁人类的健康的多发病和常见病。手术、化疗和放疗是治疗恶性肿瘤的三大传统疗法。肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，提高肿瘤的免疫原性，制备高效的肿瘤疫苗已成为免疫治疗的热点。最有效的疫苗必须既能激活CD4⁺T细胞又能激活CD8⁺T细胞，因此基于树突状细胞的免疫治疗和肿瘤疫苗具有极大的开发及临床应用价值。

树突状细胞(dendriticcells，DCs)是体内功能最强的专职抗原提呈细胞(antigenpresentingcell，APC)，可以通过HLA限制的方式向处女T细胞呈递抗原，能够高水平表达MHC-I、MHC-II类分子，可以分泌免疫刺激因子，表达黏附和共刺激分子，从而诱发CD4⁺Th细胞的有效初始化和产生强效的抗肿瘤CTLs，制备DC疫苗的策略旨在诱导抗原特异性免疫应答和形成免疫记忆。目前，将自体/异体肿瘤细胞或肿瘤抗原与树突状细胞融合，虽可增强其免疫原性，提高CD8⁺T细胞的杀瘤活性，但杀伤效应有限，操作复杂，成本高昂，且肿瘤特异性抗原筛选困难，难于大规模临床应用。

而佐剂是一种非特异性的免疫增强剂，将体液免疫转变为细胞免疫，改变免疫球蛋白的种类和亚类，消除免疫耐受性从而增强免疫反应。理想的佐剂应该有以下特征：能促进体液和细胞介导的免疫，也能作用于弱免疫性抗原，而且不引起有害的副作用，能以不同途径免疫，也能用于不同抗原，能在免疫抑制个体中发挥作用，应用于食用动物不应留有毒素残留，能有效影响免疫反应质量，并且性能稳定、便宜而且容易产生。

树突状细胞作为体内功能最强的专职抗原提呈细胞，是连接抗原与免疫应答细胞以激发有效抗肿瘤免疫应答反应的桥梁。基于活化树突状细胞的肿瘤疫苗，通常以自身肿瘤细胞和同种异体DC融合，产生的融合细胞表达肿瘤抗原并具DC的共刺激能力；或以肿瘤相关抗原、肿瘤细胞溶解物负载DC疫苗，可在不同癌症的治疗中产生肿瘤特异性CD8⁺T细胞免疫应答。但其临床应用中发现许多肿瘤缺乏明确的特异性抗原肽，且单一抗原肽负载DC增加了诱导多样化肿瘤免疫耐受的危险性，这使得肿瘤成分负载DC的免疫治疗缺乏有效靶点。

鞭毛蛋白，是构成细菌的鞭毛纤维的粒状蛋白质，具有较强的抗原性，可以通过自身激发先天性免疫系统产生应答，发挥较强的免疫佐剂作用。我们已经确定Toll-like受体(TLR)功能特性，先天性免疫系统精确熟练的检测入侵的病原微生物。通过TLR识别微生物组分启动信号转导途径，从而触发基因的表达。这些基因产物控制先天免疫反应和进一步指导抗原特异性获得性免疫的发展。

TLR5是鞭毛蛋白受体的一部分，主要表达于肺和肠上皮细胞、单核/巨噬细胞，小肠的固有层未成熟树突状细胞，是鞭毛蛋白的受体。在体内，鞭毛蛋白能够增强抗原特异性CD4⁺T细胞扩增和记忆的发展，与TLR-5相互作用，诱导产生了促炎症反应和激活宿主的树突状细胞。此外，鞭毛蛋白能诱导大量促炎性介质，如TNF-α、IL-1、IL-6、MIP-3α和iNOS，可参与细菌相关病理的发展。类似于内毒素，鞭毛蛋白是全身性炎症反应的有效介质。

热休克蛋白(HSP)gp96是一种高度保守和呈单态性的蛋白质。gp96可与DC表面的受体(如CD91、CD40、Toll-like受体和清道夫受体等)相互作用，通过CD14PTLR2和CD14PTLR4介导的信号转导途径诱导DC成熟并增强其功能，促进CD8⁺和CD4⁺T细胞细胞增殖和分泌细胞因子。能与细胞内大量多肽非共价结合而不受细胞单倍型和MHC分子的影响，包括细胞中的肿瘤抗原、病毒抗原或胞内细菌抗原。gp96-肽复合物也可在体外形成，并具有与体内相似的免疫活性。gp96-肽复合物通过gp96的特异性受体CD91介导的内吞被抗原提呈细胞摄取，然后通过内源性途径将其结合的抗原肽提呈给MHCI类和II类分子，从而启动特异性T细胞CD8⁺和CD4⁺T细胞免疫应答。

综上所述，开发简便、高效、多功能的免疫佐剂迫在眉睫，然而，现有技术中没有将鞭毛蛋白与热休克蛋白融合gp96从而作为免疫佐剂的研究。