[发明专利]一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法

说明书

本发明涉及一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法。该方法主要步骤是：取室内烟草种子发芽获得的无菌苗叶片，采用CTAB小样法提取烟草基因组DNA，并以此DNA为模板使用烟碱转化特异引物进行PCR扩增，采用2％的琼脂糖凝胶电泳分离和展示PCR扩增产物，在凝胶成像系统中观察、读取和统计分子标记带谱，并与对照特征带谱进行比较以筛选烟草高和低烟碱转化材料。本发明所述方法不受环境条件和季节影响，也不需人工化学诱导烟碱转化，将高和低烟碱转化株筛选提前至播种前，大大节约了时间成本和经济成本，而且本方法精准高效，操作简便，易于集中和推广，可用于不同烟草类型高和低烟碱转化材料的筛选，也可用于针对烟碱转化特定性状进行的快速纯化和鉴定。

技术领域

本发明涉及一种早期筛选烟草高和低烟碱转化株的方法，特别涉及一种采用烟碱特异引物PCR扩增且根据特征带谱早期筛选白肋烟和马里兰烟烟草高和低烟碱转化株的方法，属于烟草种植技术领域。

背景技术

已有研究表明，普通烟草主要包括四种生物碱：烟碱、降烟碱、新烟草碱和假木贼碱四种。普通烟草属于烟碱积累型，烟碱占总生物碱含量的90％以上，降烟碱是第二大生物碱，但一般也只占总生物碱含量的2-5％，另外两种生物碱含量极低。降烟碱亦称为去甲基烟碱，主要由烟碱在去甲基化酶的作用下脱甲基形成。虽然降烟碱含量较低，但由于降烟碱易于在烟叶调制和陈化过程中在微生物和亚硝酸盐联合作用下发生亚硝化反应，生成具有致癌作用的烟草特有亚硝胺(TSNAs)，另外，也会降低烟叶香味品质，影响烟叶使用价值。卷烟中有25-45％的TSNAs直接来自于烟叶，因此，降低烟叶TSNAs含量、提高卷烟安全性已成为国际烟草届的共识和关注焦点。

自上个世纪50年代起，研究人员开始关注烟碱转化的遗传控制机理，研究表明，该性状受两个连锁的显性基因位点CS和CT控制，分别来源于烟草祖先中林烟草和绒毛状烟草，因连锁而呈单基因显性遗传特点。随着生物化学和分子生物学技术的进步，首先确认了烟碱在烟碱去甲基化酶(nicotine N-demethylase,NND)的催化下去甲基合成降烟碱的生化过程；另外，采用群体遗传学分析、化学诱变、芯片杂交、同源克隆、酵母表达、转基因等技术先后克隆和分析了五个控制烟碱转化过程的关键基因：CYP82E2、CYP82E3、CYP82E4v1、CYP82E5v2和CYP82E10，其中前两个基因在普通烟草中因进化过程中发生替换突变而失去了具有编码有活性的NND酶的功能，CYP82E4v1是控制烟碱转化最主要的基因，属于衰老诱导型基因，CYP82E5v2和CYP82E10是烟碱转化的次要影响基因，分别在鲜叶和根部特异表达。

2010年，中国烟草基因组计划正式启动，2013年底完成林烟草、绒毛状烟草和栽培烟草三个烟草的全基因组测序和组装，本发明人利用烟草全基因组数据，对已克隆的上述五个基因在白肋烟和马里兰烟高、低烟碱转化极端表型的材料中进行了基因组和表达谱的多态性检测，结果未发现可靠多态性和显著的表达水平差异，这表明白肋烟和马里兰烟烟草材料中可能存在新的影响烟碱转化的基因位点，对白肋烟和马里兰烟高、低烟碱转化极端表型材料采用了集团分离分析法(Bulked Segregation Analysis，BSA)，获得一个稳定的遗传多态性，最终开发成为本发明中所使用的烟碱转化特异引物，该特异引物稳定可靠，可用于白肋烟和马里兰烟高、低烟碱转化材料筛选。