[发明专利]一种增强外源基因表达的方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种增强外源基因表达的方法。

(二)背景技术

生物技术是一种有效改良植物性状的方法。在目标基因表达框中加入增强子序列是确保外源基因在转基因植物中高水平表达的有效方法。在现代基因工程育种中，经常需要同时将多个不同的基因转入到同一植物受体中，因此T-DNA往往同时含有多个基因的表达框。研究显示，T-DNA的长度与农杆菌转化效率成负相关，T-DNA越长，转化效率越低。同时，T-DNA序列越长，基因操作的难度也越大。因此在T-DNA设计中，如何有效利用基因增强子序列，在不大幅度加长T-DNA的情况下提高外源基因的表达水平具有重要的意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种能同时提高T-DNA中多个基因表达强度的基因增强子序列，以及通过在T-DNA中加入一段增强子调控序列，提高调控序列两侧目的基因的转录水平，从而提高目的基因的表达量。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种增强外源基因表达的方法，所述方法为：将基因增强子连接在两条目的基因表达框之间，所述基因增强子的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。优选所述目的基因为抗虫基因和抗草甘膦基因。

进一步，所述基因增强子连接在抗虫基因表达框3’端和抗草甘膦基因表达框5’端之间。

进一步，所述基因增强子连接在抗虫基因表达框5’端和抗草甘膦基因表达框5’端之间。

进一步，所述基因增强子连接在抗虫基因表达框5’端和抗草甘膦基因表达框3’端之间。

进一步，所述抗虫基因表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，表达框中1-2025bp为玉米polyubiquitin-1基因启动子，表达框中的2026-5886bp为抗虫融合基因，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，表达框中5887-6093bp为玉米PEP carboxylase基因终止子。

进一步，所述抗草甘膦基因表达框的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示，表达框中1-2020bp为玉米polyubiquitin-1基因启动子，表达框中2021-3535bp为连接有AHAS信号肽的抗草甘膦基因，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，表达框中3536-3732bp为花椰菜花斑病病毒(Cauliflower Mosaic Virus,CaMV)的35S终止子。

在植物中，基因增强子能够有效增强序列5’和3’端两侧外源基因表达框中的目的基因的转录水平，从而提高外源基因表达量。所述外源基因的表达是通过将外源基因连接到T-DNA载体中，然后将载体转入宿主内来实现。所述方法是将基因增强子连接在两条目的基因表达框之间，然后构建T-DNA载体，具体所述T-DNA中各元件的排列顺序为T-DNA右臂序列、抗虫表达框、基因增强子、抗草甘膦表达框和T-DNA左臂序列，其中基因增强子可以是位于抗虫基因表达框3’端和抗草甘膦基因表达框5’端之间(如图1中A所示)，调控基因也可以是位于抗虫基因表达框5’端和抗草甘膦基因表达框5’端之间(如图1中B所示)，或者是调控基因位于抗虫基因表达框5’端和抗草甘膦基因表达框3’端之间(如图1中C所示)。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供一种可以大幅度提高基因增强子5’和3’端两翼基因的转录水平，从而增强外源基因的表达量，同时提高抗虫和抗草甘膦基因的表达，获得抗虫和抗草甘膦同时高表达的转基因植物。

(四)附图说明

图1为玉米转化载体构建示意图，LB和RB：T-DNA的边界序列；UBQ：玉米polyubiqutin-1启动子；EN：增强调控序列；G10evo：抗草甘膦EPSPS基因；Cry1Ab-Cry2Aj：抗虫Bt融合基因cry1Ab-cry2Aj，Pepc ter:玉米PEPC基因终止子，35S ter:花椰菜花斑病病毒(Cauliflower Mosaic Virus,CaMV)35S终止子，A、B、C为增强调控序列元件不同排列顺序。