[发明专利]含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统及方法

权利要求书

1. 一种含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统，由肝组织固定装置（6）、多层滤过装置（36）、磁力搅拌器（34）、第一蠕动泵（38）、储液容器（39）和第二蠕动泵（40）组成，其特征在于，所述肝组织固定装置（6）设置在多层滤过装置（36）内，肝组织固定装置（6）和多层滤过装置（36）之间通过管道依次连接第一蠕动泵（38）、储液容器（39）和第二蠕动泵（40）；

所述肝组织固定装置（6）是由多个固定板和活动板组成的中空正方体结构，所述固定板和活动板上均开有筛孔（13），所述固定板包括紧密衔接的第一固定板（1）、第二固定板（5）和第三固定板（7）均不能活动，第一固定板（1）、第二固定板（5）和第三固定板（7）共同构成立方体的三个固定面；所述活动板包括第一活动板（9）和第二活动板（8），第一活动板（9）通过第一滑轮（4）在第二滑轮轨道（3）上滑动，第二活动板（8）通过第二滑轮（12）在第一滑轮轨道（11）上滑动，第一活动板（9）上设有多个间隔相等的交叉缝（10），交叉缝（10）的一端封闭且与第一活动板（9）主体相连，交叉缝（10）的另一端开放且容纳第二活动板（8）穿过，第一活动板（9）和第二活动板（8）构成立方体的两个活动面；第二固定板（5）和第二活动板（8）上均开设有位于筛孔（13）之间的固定孔（2），固定孔（2）中穿设有固定片（14），多个固定片穿入固定孔（2）中后形成立方体的一个面；所述第一滑轮（4）和第二滑轮（12）上均设有滑轮开关；

所述多层过滤装置（36）由中空圆柱形的端盖部（16）、中间部（20）和底部（25）三部分组成，所述端盖部（16）内设有立方体的中空空间（15），且中空空间（15）与肝组织固定装置（6）吻合，端盖部（16）的内部下端设有第一筛网（17），端盖部（16）的下端还设有端盖部螺纹（18），所述中间部（20）的顶端设有与端盖部螺纹（18）衔接的上端螺纹（19），端盖部螺纹（18）与上端螺纹（19）形成第一螺纹连接处（30）；所述中间部（20）的内部设有第二筛网（21），第一筛网（17）与第二筛网（21）形成的空间为细胞团容纳腔体（31），所述第二筛网（21）上放置有第一磁珠（23），所述中间部（20）的下端设有下端螺纹（22），所述底部（25）的顶端设有与下端螺纹（22）衔接的底部螺纹（24），下端螺纹（22）和底部螺纹（24）形成第二螺纹连接处（32），所述底部（25）的内部设有第三筛网（26），第二筛网（21）与第三筛网（26）形成的空间为细胞富集腔体（33），所述第三筛网（26）上放置有第二磁珠（29），位于第三筛网（26）的底部（25）内空间为灌流液暂储腔体（28），所述底部的侧壁上设有液体出口（27）。

2.根据权利要求1所述的含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统，其特征在于，所述第一筛网（17）、第二筛网（21）和第三筛网（26）的孔径依次减小。

3.根据权利要求1所述的含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统，其特征在于，所述固定板、活动板和固定片由金属材料、不锈钢或聚碳酸酯材料制成；所述多层过滤装置（36）的外壳由透明的聚碳酸酯材料制成。

4.一种如权利要求1所述的含组织固定及多层滤过装置的原代肝细胞分离系统的分离方法，其特征在于，具体步骤如下：

（1）肝组织固定

先对反应器各部件进行灭菌处理，分离肝细胞的各步骤均在无菌的超净台或者百级实验室中进行，将肝组织放置在三个固定板围成的空间内；安装第二活动板（8），沿着第一滑轮轨道（11）滑动第二活动板（8）直至压紧肝组织，然后锁闭第一滑轮（4）；安装第一活动板（9），使得第二活动板（8）在合适位置穿过交叉缝（10），沿着第二滑轮轨道（2）滑动第一活动板（9）直至压紧肝组织，然后锁闭第二滑轮（12）；在第二活动板（8）及第二固定板（5）上的固定孔（2）中贯通插入固定片（14），由此形成六个面的立方体固定装置用于固定用于细胞分离的的肝组织；

（2）系统的组装

将端盖部（16）、中间部（20）和底部（25）通过相应的螺旋组装好，并放置第一磁珠（23）和第二磁珠（29），以形成多层滤过装置（36）；将固定有肝组织的肝组织固定装置放置在中空空间（15）内，并液体管路连接好蠕动泵、磁力搅拌器（34）和储液容器（39）；

（3）肝组织胶原酶灌流液灌流

灌流喷头通过筛孔（13）插入肝组织脉管中，或通过穿刺针多点位刺入肝组织中，打开第二蠕动泵（40），将储液容器（39）中胶原酶灌流液灌流至肝组织中，在胶原酶的作用下肝组织中的肝细胞逐渐分离，并随灌流液往下流，当多层滤过装置（36）液面超过第一网筛（17）高度时，打开磁力搅拌器（34）调节转速，使第一磁珠（23）和第二磁珠（29）缓慢旋转，并立即打开第一蠕动泵（38），以相应第一蠕动泵（38）相应的速度将灌流液暂储腔体（28）中的灌流液通过液体出口（27）排出并回流至储液容器（39）中；灌流过程中，可去除固定片（14），并通过刀片切割帮助肝细胞充分解离；

（4）原代肝细胞收集

灌流结束时停止第二蠕动泵（40），第一蠕动泵（38）继续工作，抽吸多层滤过装置（36）中的灌流液，当灌流液液面低于第二螺纹连接处（32）高度时停止抽吸，并停止磁力搅拌器（34）工作，按螺纹拧开分离中间部（20）和底部（25），用移液器转移原代肝细胞悬液至相应的容器内，以进一步离心获得原代肝细胞。