[发明专利]一种桐花鱼的分子鉴定方法

权利要求书

1.桐花鱼的分子鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.鱼鳞 DNA的提取：在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞4-6片，置于1.5毫升灭菌离心管中，加入30-50微升裂解液，将鳞片浸没于裂解液中，在65摄氏度静置2小时，移至95摄氏度静置20分钟，取1-3微升上清用于PCR扩增；

B.PCR扩增：进行PCR扩增；PCR反应体系包括1-3微升含100纳克DNA的DNA模板，3微升10×buffer，2.4微升脱氧核糖核苷三磷酸，1微升正引物，1微升反引物，0.3微升Taq聚合酶，无菌水补足至30微升；

C.酶切：取10微升PCR产物，加入2微升10×buffer，2微升XbaI，用无菌水补足至20微升，置于37摄氏度3～5小时；

D.电泳检测与鉴定：取5微升酶切产物与1微升6×loading buffer混合，在2％的琼脂糖凝胶上点样，120V条件下电泳15分钟，用凝胶成像系统拍照分析电泳结果，根据电泳条带判定该鱼是否桐花鱼；

步骤B中，正向引物序列为5’-GAGACCTGTATGAATGGCTAA-3’，反向引物序列为5’-ACTCAGATCACGTAGGACTT-3’，扩增产物为478bp。

2.根据权利要求1所述的桐花鱼的分子鉴定方法，其特征在于：步骤A中，裂解液包含10毫摩尔pH为8.2的Tris-HCl，50毫摩尔KCL，体积百分比是0.3％的吐温20，体积百分比是0.3％的乙基苯基聚乙二醇和体积百分比是1％的蛋白酶K。

3.根据权利要求1所述的桐花鱼的分子鉴定方法，其特征在于：步骤A中，用尖头镊子在鱼体尾部或腹部取鲜活鱼鳞。

4.根据权利要求1所述的桐花鱼的分子鉴定方法，其特征在于：步骤A中，将鳞片浸没于裂解液中，在65摄氏度恒温水浴槽中静置2小时，移至95摄氏度恒温水浴槽静置20分钟，取1-3微升上清用于PCR扩增。

5.根据权利要求1所述的桐花鱼的分子鉴定方法，其特征在于：步骤B中，PCR反应程序为95℃变性5分钟；95℃变性30秒，55℃变性30秒，72℃变性45秒，30个循环；72℃延伸10分钟，扩展完成。

6.根据权利要求1所述的桐花鱼的分子鉴定方法，其特征在于：步骤C中，置于37摄氏度恒温水浴槽3～5小时。

7.根据权利要求1所述的桐花鱼的分子鉴定方法，其特征在于：步骤D中，若电泳结果出现大小分别为169bp和308bp的两条电泳条带，则判定该DNA样品来自桐花鱼。