[发明专利]一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株及发酵方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术、微生物工程和制药工程的领域，具体涉及到一株高产磷脂酶C的蜡样芽孢杆菌突变株，还涉及到该突变株的发酵方法，还涉及到该突变株在制备磷脂酶C的应用。

技术背景

一、磷脂酶C的生理活性及市场

生物细胞膜是由50％以上的磷脂及其脂质组成，磷脂由甘油磷脂和鞘磷脂组成。磷脂不但在细胞代谢、信号传导及细胞生理活性的维持中起着非常重大的作用，而且在血小板的粘附作用和聚集作用中起着关键作用。血小板的粘附和聚集可引起人血栓的形成，血栓可阻止机体组织出血，有利于止血作用，使人不至于出血过多引起生命垂危；但在大多数状态下，血栓造成的血管腔阻塞及其对机体的影响。血栓导致心肌梗塞、脑梗死、急性冠状动脉综合症，外周动脉疾病和肺栓塞等疾病，不但危及人类生命，而且造成大量的残疾人员，使许多人尤其是老年人瘫痪，卧床不起，痴呆等等，对本人亲属和社会造成很大的损失和负担。

据报道，全球每年死于各类血栓病的人数有2600万人，占死亡总人数的29％，是排在导致人类死亡的心血管疾病、传染病和癌症三大因素之首。在我国每年有300万以上的人死于各种心脑血管疾病，占总死亡率的45％左右，也排在死亡因素之首。可见研制新的抗血栓药物非常之必要且意义非常重大。

在近十年中，由于全球老年化进程加快，抗血栓药从2005年的133亿美元增加到2010年的230亿美元，年平均增长11.6％，其中2009年，仅抗血栓药氯吡格雷销售额98亿美元，另一个依诺肝素销售42亿美元。预计2015年抗血栓药物达到市场销售规模340亿美元，约合人民币2100多亿元。这是一个巨大的数字。曾有报道，日本的一种一类新药拯救一个药厂，一个公司的存活，甚至一个国家人民的新生。

我国抗血栓药物市场规模一直增长很快，由2007年的35.2亿元增长到2011年的81.35亿元，最近四年平均复合增长率23.3％，远远超过了国家GDP的增长率。预计2015年我国老年人可达1.8亿人，老年人口的快速加剧，其面临心脑血管疾病发病率和死亡率也将快速增加。抗血栓药物将获得大量应用和收益。抗血栓药物市场规模可达170亿元，比2011年增长1倍多。

二、抗血小板药物

血小板在止血、血栓形成、动脉粥样硬化等过程中起着重要作用。抗血小板药物主要通过抑制花生四烯酸代谢，增加血小板内cAMP浓度等机制而抑制血小板粘附、聚集和分泌功能。

我们研究获得从微生物中提取的磷脂酶C(phosopholipase,简写PLC，下同)经过兔、狗以及人的试验，具有预防血栓形成，溶栓的功能，并改变蛋白多肽药物注射剂而成为口服剂，使患者口服方便，减少痛苦和心理负担，制剂稳定性能好，抗血小板功能效果好。PLC制剂无毒性且安全。

三、PLC产生菌

在国外，对PLC产生菌研究较早，陆续发现在G⁺Bacillus cereus,B.thuringiensis和G^-Pseudomonad aeruginosa等十多种微生物中产生PLC。在国内，陈涛等报道了粘附沙雷氏菌武汉株CW-W-90-3产生PLC，后来又报道出蜡样芽孢杆菌深圳株754-1产生PLC，因为该菌为芽孢杆菌，存活期长，易于保存，稳定性能好。因而，目前研究多集中于B.cereus和B.thuringiensis这两种芽孢杆菌，它们均为革兰氏阳性菌。因为许多革兰氏阴性菌产生的PLC具有溶血而无实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株，该菌株高产磷脂酶C,该菌株已于2015年5月6日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2015277,分类命名：蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)Ⅲ-2-6，地址：中国武汉武汉大学。

本发明另一个目的在于提供一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株的发酵方法，本发明提供的方法简化了制备工艺和设备，适于大规模生产。

本发明最后一个目的在于提供一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株在制备磷脂酶C(phosopholipase,简写PLC)制剂中的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施。

一种高产磷脂酶C的蜡状芽孢杆菌突变株，通过以下方式筛选得到：

活化蜡样芽孢杆菌深圳株754-1株，将该菌株在LB培养基稀释生长，有明显分解卵黄特征，培养2-3天后，洗成菌悬浮液，备用。