[发明专利]5’端不受碱基限制的gRNA的制备方法在审
申请号: | 201510421000.3 | 申请日: | 2015-07-16 |
公开(公告)号: | CN105039309A | 公开(公告)日: | 2015-11-11 |
发明(设计)人: | 秦伟;林硕;李松 | 申请(专利权)人: | 深圳市盛捷生物技术有限公司 |
主分类号: | C12N15/10 | 分类号: | C12N15/10 |
代理公司: | 广州华进联合专利商标代理有限公司 44224 | 代理人: | 生启 |
地址: | 518000 广东省深圳市宝安*** | 国省代码: | 广东;44 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 不受 碱基 限制 grna 制备 方法 | ||
技术领域
本发明涉及分子生物学领域,特别是涉及一种5’端不受碱基限制的gRNA的制备方法。
背景技术
近年来锌指核酸酶(zinc-fingernucleases)以及转录激活因子样效应物核酸酶TALENs(transcriptionactivator-like(TAL)effectornucleases)等基因组编辑技术使得人们精确修饰基因组成为可能。在识别基因组上的DNA位点时,无论是锌指核酸酶还是转录激活因子样效应物核酸酶都需要人工合成一个很大的识别蛋白,从实验效率上来讲,大大地限制了这些技术的应用。近2年来,一种称之为CRISPR(ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats)/Cas9的技术涌现出来,由于其高效、设计简单、成本低廉,大大的提高了其可用性,使得人们快速编辑基因组成为可能。
CRISPR/Cas9系统原本是一种原核生物特有的针对外源性遗传物质的免疫系统,通过序列特异的RNA介导,切割降解外源性DNA,从而提供免疫性。研究表明,原始的该系统一共包含Cas9蛋白、tracrRNA、crRNA以及RNaseIII四种成分。作为一种位点特异性的基因编辑系统,其识别的特异性是由crRNA序列决定的,人工合成crRNA序列使得Cas9系统识别并结合到与该crRNA互补的DNA序列上,最终介导Cas9蛋白特异性的切割该杂交区域。除了crRNA保证识别特异性外,一个被称之为原型间隔序列毗邻区(proto-spaceradjacentmotif,PAM)的序列对于Cas9系统能够有效稳定的发挥作用有着重要的意义。该序列其使得双链RNA复合体与靶序列精准的结合,并有效地避免了自身结合现象的发生。为了进一步的简化操作过程,研究人员发现将crRNA和tracrRNA合并到在一起,同样也能被Cas9蛋白识别,并发挥相应的剪切作用,并将其命名为sgRNA(singleguideRNA)。
最新研究结果显示,Cas9作为一种基因组编辑工具已经成功应用于酵母、植物、线虫、果蝇、斑马鱼、小鼠和人的细胞模型之中。虽然该系统操作简单、但是其仍然有自身的不足。一是由于sgRNA对靶序列识别的长度只有20个碱基,且Cas9蛋白对sgRNA5′端序列与靶位点的错配不敏感,这使得Cas9-sgRNA技术的脱靶率比较高。目前人们已经可以利用成对的突变Cas9突变核酸酶(Cas9D10A),以及Cas9-FokI融合蛋白等造成双位点识别切割,有效的提高了Cas9-gRNA技术的特异性。二是Cas9系统的识别位点需要满足(N20NGG)的条件,它不像TALEN可以全基因组选择,这就一定程度上限制了位点的选择,理论上基因组上每8个碱基才会出现这样一个位点。再加上sgRNA需要promoter启动,如目前最广泛应用的U6启动子。该启动子还需要第一位为G碱基,以确保转录的有效性,使得位点选择变为(GN19NGG)。如果换成体外转录合成sgRNA,则需要用到T7或者SP6启动子,同样这些启动子也需要受到起始碱基为G的限制,使得基因组上选择位点的可能性变成了每32个碱基才会出现一个位点。从单纯的造成基因突变获得突变体来看,虽然有这些限制存在,但是我们依然可以很好的找到位点来达到我们的目的,但是基因编辑系统更为重要的意义在于它可以精确的修饰基因组任意位置。研究表明,双链DNA断裂(Doublestrandbreak,DSB)离修饰位点越近,其相应的成功率就越高,这就使得突破位点选择的一些限制显得意义极其重大。
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