[发明专利]一种片段法固相合成齐考诺肽的方法

权利要求书

1.一种片段法固相合成齐考诺肽的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)以氨基树脂为固相载体，再按序列依次偶联7个Fmoc保护氨基酸，得侧链保护的齐考诺肽片段A[19-25]肽树脂；

齐考诺肽片段A[19-25]肽树脂为：

H-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-氨基树脂；

(2)以CTC树脂为固相载体，按照以下序列从C端向N端依次进行缩合反应得到侧链全保护的齐考诺肽片段B[12-18]肽树脂、片段C[6-11]肽树脂和片段D[5-1]肽树脂；

齐考诺肽片段B[12-18]肽树脂为：

Fmoc-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-CTC树脂；

齐考诺肽片段C[6-11]肽树脂为：

Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Leu-CTC树脂；

齐考诺肽片段D[1-5]肽树脂为：

Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-CTC树脂；

(3)将片段B、C、D的肽树脂进行裂解，得到全保护肽片段B、C、D，其结构为：

齐考诺肽片段B[12-18]为：

Fmoc-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-OH；

齐考诺肽片段C[6-11]为：

Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Leu-OH；

齐考诺肽片段D[1-5]为：

Fmoc-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-OH；

(4)齐考诺肽片段A[19-25]肽树脂与全保护肽片段B在缩合剂存在下发生接肽反应，生成14个氨基酸的肽树脂，再按照同样的操作依次连接全保护肽片段C和D，最后脱除Fmoc，完成齐考诺肽线性肽树脂的制备；

齐考诺肽线性肽树脂的结构如下：

H-Cys(Trt)-Lys(Boc)-Gly-Lys(Boc)-Gly-Ala-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Ser(tBu)-Arg(pbf)-Leu-Met-Tyr(tBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-Gly-Ser(tBu)-Cys(Trt)-Arg(pbf)-Ser(tBu)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-氨基树脂；

(5)肽树脂经裂解试剂裂解得到齐考诺肽的线性肽粗品；

(6)将齐考诺肽的线性肽用乙酸铵和EDTA的缓冲水溶液溶解后，加入辅助氧化剂，调节溶液pH值至7.5～8.5，2～8℃下低温静置反应，HPLC监测反应终点，得到含二硫键的齐考诺肽粗品；

所述步骤(6)中齐考诺肽线性肽的浓度为0.5～2mg/ml，乙酸铵的浓度为0.5～0.7mol/L；EDTA的浓度为0.5-1.5mmol/L；

所述步骤(6)中辅助氧化剂组合为GSH(还原型谷胱甘肽)/GSSG(氧化型谷胱甘肽)、半胱氨酸/胱氨酸中的一种；

所述氧化剂组合GSH(还原型谷胱甘肽)/GSSG(氧化型谷胱甘肽)中GSH(还原型谷胱甘肽)的加入浓度为0.1-10mmol/L，GSSG(氧化型谷胱甘肽)的加入浓度为0.05-1mmol/L；

所述氧化剂组合半胱氨酸/胱氨酸中半胱氨酸的加入浓度为0.1-10mmol/L，胱氨酸的加入浓度为0.05-1mmol/L；

(7)将齐考诺肽粗品溶液pH值调至3-6后经制备色谱纯化，冻干得到齐考诺肽精肽。

2.根据权利要求1所述片段法固相合成齐考诺肽的方法，其特征在于，步骤(1)所述氨基树脂为Rink Amide树脂或Rink Amide-AM树脂，替代度为0.2～0.5mmol/g。

3.根据权利要求1所述片段法固相合成齐考诺肽的方法，其特征在于：步骤(2)中所述的CTC树脂的替代度为0.6～1.2mmol/g。