[发明专利]编码突变的EPSPS基因、其表达载体、表达产物及其应用

权利要求书

1.一种编码突变的EPSPS基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。

2.权利要求1所述EPSPS基因编码的EPSPS蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。

3.一种抗除草剂基因CTP2-EPSPS，含有叶绿体转运肽CTP2和权利要求1所述EPSPS基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.5所示。

4.权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS表达的抗除草剂蛋白。

5.一种含有权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS的植物表达载体。

6.根据权利要求5所述表达载体，其特征在于，该表达载体为可直接转化玉米的双价载体。

7.一种由权利要求6所述植物表达载体转化的宿主细胞LBA4404。

8.权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS或权利要求5所述表达载体在培育转基因植物中的应用。

9.权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS或权利要求5所述表达载体在玉米遗传转化中的应用。

10.一种培育抗草甘膦转基因玉米的方法，包括如下步骤：

（1）EPSPS基因合成

人工合成权利要求1所述编码突变的EPSPS基因或权利要求3所述抗除草剂基因CTP2-EPSPS，并将其装载在质粒载体pUC57上，得到含有CTP2-EPSPS基因的pUCCTP2-EPSPS载体质粒；

（2）植物表达载体构建

①用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切T载体质粒pUCCTP2-EPSPS，用凝胶回收纯化试剂盒回收CTP2-EPSPS片段；同时用限制性内切酶XbaI和SacI双酶切植物表达载体CPB，用凝胶回收纯化试剂盒回收酶切后的CPB片段；

②将上步纯化后的两片段进行连接反应，构建成植物表达载体pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS，启动子为35S，标记基因为吸水链霉菌的抗除草剂基因Bar；

③将质粒pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS用XbaI和SacI进行酶切鉴定，鉴定出植物表达载体中含有高赖氨酸基因CTP2-EPSPS片段，表明载体构建正确；

（3）农杆菌转化

采用根瘤农杆菌介导法将含抗除草剂基因CTP2-EPSPS片段的重组表达载体pCAMBIA1300-CTP2-EPSPS导入玉米愈伤组织，经过侵染、恢复、选择、再生、炼苗阶段，获得转基因幼苗；

（4）育种

将转基因幼苗从培养瓶中取出移栽至营养钵或田间，常规条件下培育，转基因植物开花后套袋自交或姊妹交结实，成熟后收获种子。