[发明专利]一种胰高血糖样素肽-1的融合蛋白、其制备方法及其药物组合物

说明书

技术领域

本发明涉及糖尿病相关的药物领域，具体而言，本发明涉及具有延长胰高血糖素样肽类体内半衰期的重组蛋白，及其制备方法和药物组合物，以及在制备糖尿病药物方面的应用。

背景技术

本发明涉及的胰高血糖样素肽-1(GLP-1，glucagon-likepeptide-1,以下简称：GLP-1)主要是由小肠L细胞分泌的一种37个氨基酸组成的多肽，其活性形式为GLP-1(7-37)OH和GLP-1(7-36)NH2(Mojsov S,J Clin Invest.1987Feb；79(2):616-9)。GLP-1有明显减低人用餐后的血糖，能刺激胰岛素的产生，同时还能起到一定减肥效应，并且不会引起低血糖症(Drucker D J,Diabetes.1998 Feb；47(2):159-69)。近期研究还表明GLP-1对胰腺再生作用(Drucker D J,2003Dec；144(12):5145-8)。然而，GLP-1(7-37)的血清半衰期仅仅为3-5分钟，涉及GLP-1肽的治疗用途，来自蜥蜴唾液的人的GLP-1类似物Exendin-4的合成物Exenatide，2005年在美国作为降糖药上市，血中的半衰期到2.5小时左右，每天需要在早饭及晚饭前注射给药，每天多次注射给药在临床使用中非常不方便，因此，延长GLP-1类似物的体内时间对于方便临床应用具有重要的意义。

目前已经有不少研究采用GLP-1类似物融合蛋白技术解决GLP-1类似物在体内的存留时间[CN90101167.3、CN200710018734.2、 CN200410054397.9、CN01820232.2、CN200380110152.7、CN200510039265.3、CN200610127237.1、CN200910009642.7]，然而，现有的技术与临床理想的目标还有很大距离。本发明是针对现有技术的不足，采用融合蛋白技术克服了GLP-1半衰期短的问题。

发明内容

本发明的一个目的是针对GLP-1是多肽分子，无法进行口服吸收的缺陷，通过与疏水蛋白的融合表达形成一个具有稳定结构的、稳定的、可口服的治疗2型糖尿病药物。

本发明的另一个目的是提供含有通式Ⅰ结构的GLP-1融合蛋白作为有效成分以及一种或多种药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂的药用组合物，及其在制备糖尿病治疗药物中的应用。

现结合本发明的目的对本发明逐一加以描述。

本发明胰高血糖样素肽-1的融合蛋白如下述所示：具有通式Ⅰ，

GLP-1—[SGTPTPTPTPTGEF]—融合蛋白

通式Ⅰ

其中，

连接肽为SGTPTPTPTPTGEF；

GLP-1的氨基酸序列为：

⁷-HAEGTFTSDVSSYLEGQAAKEFIAWLVKGR-³⁶

融合蛋白为：疏水蛋白，其氨基酸序列为QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVISDVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV。

本发明的通式I的GLP-1融合蛋白是通过下述方法制备的：

1.构建编码本发明的融合蛋白的DNA

本发明中的融合蛋白为疏水蛋白，本发明采用标准的PCR(聚合酶链式反应)方法对相关的融合蛋白的mRNA进行扩增，并按照领域内众所周知的方法进行DNA扩增，疏水蛋白的DNA序列SEQ ID NO 1。

2.构建本发明中GLP-1的DNA

本发明参考专利CN1363654A中GLP-1中双链DNA全长的合成方法，进行GLP-1双链DNA全长的合成，本发明中GLP-1经过标准的DNA测序进行序列验证。

3.构建本发明中GLP-1融合蛋白载体

利用本领域常规的PCR突变技术制备连接有连接短肽的GLP-1用以与蛋白表达质粒的连接；连接技术是本领域常规操作，本发明利用PCR将含有连接肽的GLP-1与蛋白表达质粒通过T4连接酶(可以催化粘端或平端双链DNA或RNA的5’-P末端和3’-OH末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需ATP作为辅助因子)进行连接，得到本发明中所有融合蛋白的表达载体。一旦产生了编码完整融合蛋白的表达载体，它可以用来传染酵母菌株，生产融合蛋白。重组DNA载体转化或转染细胞的技术是本领域的常规技术。

4.用于重组表达本发明的融合蛋白的一般方法