[发明专利]白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因、其筛选方法及应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学中昆虫体内稳定表达的内参基因技术领域，具体地涉及白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因及其筛选方法及应用。

背景技术

白背飞虱White-backed planthopper(Sogatella furcifera(Horváth))，属节肢动物门，昆虫纲，半翅目，飞虱科，一生经历3个发育阶段，包括卵期、若虫期和成虫期，成虫具有迁飞习性。水稻是白背飞虱适宜寄主，白背飞虱不仅可以刺吸水稻韧皮部汁液，还可以传播多种病毒病，给水稻生产造成重大损失。白背飞虱在我国分布广泛，包括华南、华中、华北、东北以及西南稻区，西北稻区可达新疆自治区的米泉等地都有其分布。

白背飞虱完成一个生命周期需要经过卵、若虫、成虫三种虫态，属于渐变态昆虫。白背飞虱一年发生3～4代，雄成虫较雌成虫羽化早，雌成虫一生只交配1次，雄成虫可交配3～4次，雌虫产卵的部位集中于稻株基部。白背飞虱存在着形态和行为的多态现象，即迁飞型(以长翅型为代表)和居留型(以短翅型为代表)，温度对白背飞虱翅型的分化起着重要的作用，但一般情况下白背飞虱短翅型雄虫极少见。

近年来，实时荧光定量PCR(qRT-PCR)技术以其快速、灵敏、准确、重复性高、可定量、适用范围广等特点优势，已被广泛应用于基因表达分析。在使用相对定量方法时需要一个在实验组和对照组中表达量恒定的参考基因作为检测目的基因在特定条件下表达水平变化的参照物，用来归一化二者的实验数据，这里的参考基因即为内参基因。一个内参基因在特定的实验条件下能持续稳定的表达是其可应用的基本前提。理想的内参基因应该满足以下条件：不存在假基因，以避免基因组DNA的扩增；高度或中度表达；稳定表达于不同类型的细胞和组织；表达水平与目标基因相似；不受任何内源性或外源性因素的影响。常用的内参基因都是维持正常的细胞生命活动所必须的基因，如Actin、18S、GAPDH、Tublin等，但是没有一种内参基因mRNA表达水平在所有的条件下是一成不变的，一些内参基因在某种特定条件下，其表达可能发生变化。因此，研究不同的环境条件下，某一有机体内基因的表达情况，内参基因的选择至关重要。

发明内容

本发明提供的白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因，为白背飞虱不同龄期内参基因的选择提供依据。

同时本发明还提供其筛选方法及应用。

本发明根据NCBI已经公开发表的其它昆虫相关基因序列，设计简并引物，PCR获得白背飞虱6个常用内参基因部分核苷酸序列，经过克隆、测序以及与NCBI数据库Blast比对，确定为白背飞虱内参基因的部分序列；随后又基于此序列设计特异性的定量引物，建立基于SYBR Green I染料技术的RT-qPCR方法，利用荧光定量PCR技术筛选出了白背飞虱不同龄期最稳定的内参基因，从而为今后研究不同龄期基因表达水平以及白背飞虱的基因功能方面建立坚实的基础。

白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU，其核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

白背飞虱不同龄期稳定表达的内参基因A1TU的筛选方法，包括如下步骤：

(1)白背飞虱饲养：白背飞虱为实验室饲养种群，饲养于人工气候箱中，饲养条件是27±1℃，75±5％，光周期为16h光照：8h黑暗；

(2)获得内参基因序列：GenBank数据库公开的白背飞虱18S序列，登录号为JX556779.1；RPL9和RPL10的序列由转录组测序获得，其获得具体过程为利用Ion Proton II测序平台，对白背飞虱唾液腺组织总RNA进行高通量测序，根据注释结果查找获得RPL9和RPL10的序列，与数据库中的序列Blast比对，确定了RPL9和RPL10的部分序列，见SEQ ID NO：7和SEQ ID NO：8；基于NCBI已经公开的相关基因序列，设计合成了6个白背飞虱内参基因简并引物，序列如下：

(3)确定白背飞虱内参基因序列：简并引物PCR扩增获得序列进行克隆并测序，将获得序列与NCBI数据库进行Blast比对，以确定内参基因序列，见SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：8；