[发明专利]一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡

说明书

技术领域

本发明涉及细胞活体成像分析技术、暗场显微技术和纳米材料制备领域，具体地说，涉及一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡及其应用。

背景技术

近年来，等离子体纳米粒子引起了广泛关注，这些纳米粒子具有特殊的光学和物理性质，能有效吸收并散射可见光，引起金属表面等离子共振。得益于暗场显微镜和等离子体共振瑞利散射光谱的发展，等离子体纳米粒子已经被成功用于生物传感、单颗粒分析、药物运输等多个研究领域。研究表明，等离子体纳米探针已经成为研究生命体尤其是细胞的有力工具，可用于细胞成像、细胞表面识别、穿膜运输等。

肿瘤抑制蛋白p53可通过对细胞周期进行调控引发细胞凋亡，抑制肿瘤的发生和发展。在大部分肿瘤细胞中，p53蛋白的结构发生突变，活性受到抑制。因此对不同类型的p53进行细胞内原位分析和检测，对肿瘤的诊断、治疗和实时监测具有重要的意义。

目前，多种检测p53蛋白的方法已被提出。其中传统检测方法是通过免疫组织化学法(IHC)或者酶联免疫反应(ELISA)检测血清中肿瘤抑制蛋白的含量。免疫组织化学法应用比较广泛，但其主要缺陷是不同批次之间染色差异较大，重复性差。酶联免疫反应方法利用抗原抗体夹心反应检测目标蛋白，具有较好的稳定性，但该方法操作步骤繁琐，灵敏度不高。电化学纳米传感方法灵敏度高，重复性好，但该方法通常采用血清或者细胞提取物作为分析对象，因此无法实现p53蛋白的原位分析和检测，无法得到单细胞层面上p53蛋白的具体位置和分布情况。

发明内容

本发明的第一个目的在于提供一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡。

本发明的第二个目的在于提供一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡的应用。

为实现本发明第一个目的，本发明公开以下技术方案：一种可同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡，其特征在于，所述囊泡内部包裹有能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金，同时囊泡表面修饰有异硫氰酸荧光素标记的抗变异p53蛋白抗体。

作为一个优选方案，所述能特异性识别野生型p53蛋白的纳米金通过含有野生型p53蛋白识别位点的双链DNA溶液与55-65nm的纳米金溶液混合搅拌获得。纳米金的粒径优选为60nm。

为实现本发明第二个目的，本发明公开以下技术方案：纳米囊泡在活细胞内p53蛋白的成像检测中的应用，以及，纳米囊泡在制备活细胞内p53蛋白的成像检测试剂中的应用。

该囊泡进入细胞后，释放出内部的纳米金，纳米金与细胞内野生型p53蛋白的结合会引发纳米金的聚集，不同浓度的野生型p53蛋白引起的纳米金的聚集程度不同，其散射光的波长不同，暗场散射光谱也是有变化的。因此，可通过暗场显微镜来观察纳米金散射光颜色的变化并采集其散射光谱，从而对纳米金的聚集程度进行表征，进而得到细胞内野生型p53蛋白的分布信息。

同时，囊泡表面修饰的FITC(异硫氰酸荧光素)标记抗变异p53蛋白抗体可以识别细胞内的变异p53蛋白，其荧光信号强度与细胞内变异p53蛋白的浓度成正比。因此，可通过荧光显微镜得到细胞荧光图像，从而对细胞内变异p53蛋白的分布进行观察和表征。

本发明的优点在于：(1)针对传统方法操作复杂、特异性与重复性不高的问题，本方法提供了一种高特异性识别不同类型肿瘤抑制蛋白p53的纳米囊泡，提高了检测的特异性和灵敏度。(2)针对p53蛋白单细胞层面分析手段缺乏的问题，本发明采用等离子体共振成像以及荧光成像技术，待囊泡进入细胞后，利用显微镜对细胞进行原位成像，实现了单细胞层面上野生型和变异p53蛋白的同时检测。(3)本发明设计的纳米囊泡可以对药物作用下细胞内p53蛋白表达的变化进行原位监测，为研究其参与的细胞内生理过程提了供新方法。

附图说明

图1为同时检测细胞内野生型和变异p53蛋白的纳米囊泡的制备及其工作原理图。

图2为不同浓度nutlin-3(A1-5:0,B1-5:62.5μg mL-1,C1-5:125μg mL-1,D1-5:250μg mL-1)处理过的HeLa细胞与纳米囊泡及DAPI温育2小时后的显微图像(1:暗场图像,2:明场图像,3:DAPI染细胞核,4:FITC标记抗变异p53蛋白抗体的荧光图像,5:暗场图像的细节放大)，i1-i12:细胞内对应的纳米金的暗场散射光谱。

图1中的标号分别为：

1、纳米囊泡；2、纳米金； 3、十一醛；