[发明专利]一种高含量γ‑氨基丁酸茶叶提取物的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物干细胞培养技术领域，特别涉及一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法。

技术背景

γ-氨基丁酸(Gamma Aminobutyric Acid，GABA)是一种非蛋白质氨基酸，在医药行业主要应用其降血压、抗惊厥、镇痛和改善记忆的功效。在化妆品行业中，γ-氨基丁酸表现出优异的保湿和抗皱功效，广泛用于各种保湿或抗皱化妆品中。

将茶鲜叶经过一定时间的厌氧处理会产生γ-氨基丁酸，茶叶中γ-氨基丁酸是由L-谷氨酸在L-谷氨酸脱羧酶的催化作用下脱酸形成。目前国内外均通过对茶叶鲜叶加工处理，以提高γ-氨基丁酸含量，主要处理方法有厌氧处理、厌氧好气交替处理、红外线照射处理、微波照射处理、谷氨酸钠溶液综合处理等方法，处理后的茶中γ-氨基丁酸的含量在茶叶干重的0.15-0.2%。

离体培养的高等植物细胞具有合成天然产物的能力,利用这一特性，可以通过优化植物干细胞的培养条件，有目的性的使其积累更多的次生代谢产物。刘亚军等人发表的论文《茶树愈伤诱导及不同儿茶素含量细胞系筛选》，研究了不同培养条件对茶干细胞中儿茶素积累量的影响；钟俊辉等人发表的论文《茶愈伤组织培养及其茶氨酸的累积》，研究了不同培养条件对茶干细胞中茶氨酸积累量的影响。但迄今还未有研究关于不同培养条件对茶干细胞中γ-氨基丁酸积累量的影响。

当前从经过处理的茶叶鲜叶中获取γ-氨基丁酸单体，通常将加工处理后的茶叶干燥，然后使用酒精浸出，用大孔离子交换树脂进行提纯，将洗出物使用多次重结晶法获得纯度在90%以上的γ-氨基丁酸晶体。因为传统方法处理的茶叶鲜叶中γ-氨基丁酸其含量只有茶叶干重的0.15-0.2%，含量偏低，并且茶叶中含有的叶黄素含量比较高，工业提纯较为困难，会产生大量有机溶剂废液，对环境不利。

如果通过特定优选的茶叶干细胞的培养条件，可以有目的的获得高含量γ-氨基丁酸的茶叶干细胞，因为茶叶干细胞中并不存在叶黄素，可以使用特定简单的提纯工艺，节约γ-氨基丁酸提纯成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法，该方法获得的茶叶干细胞固体粉末中γ-氨基丁酸茶叶提取物含量较高，γ-氨基丁酸茶叶提取物得率高，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量高的优点。

本发明通过以下技术方案实现：一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、 摘取茶树上的绿茶嫩芽，经过体积分数70%的乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将绿茶嫩芽切成2-5mm长的小段，接种于MS培养基，控制室温在25±1℃，暗培养7天，诱导出乳白色、土黄色、浅绿色三种不同颜色的茶叶愈伤组织；

B、 制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取50-80% MS培养基、10-40%植物凝胶、3.8-7.5% NAA、3.5-7.2%蔗糖、0.01-0.3%吲哚乙酸、0.01-0.36%-苄氨基腺嘌呤、0.01-0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液，调节溶液的pH至6.3-6.7；

C、 选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得茶叶干细胞固体粉末；

D、 按质量比1:1将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物。

本发明提供了一种高含量γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养技术，可进行大规模培养获取大量的原材料，采用氨基酸分析仪测定，γ-氨基丁酸茶叶提取物的含量可达茶叶干细胞干重的7.5-10.5%，γ-氨基丁酸茶叶提取物得率可达6.0-8.5%，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量大于96%。本发明制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物可用于制备食品、保健品、化妆品以及药品。