[发明专利]一种抑制NEMA从头DNA合成现象的方法及试剂盒

说明书

本发明涉及一种抑制切克内切酶介导等温扩增(NEMA)从头DNA合成现象的方法及相应试剂盒。所述方法为，在试剂盒中使用合适的切克内切酶，增大切克内切酶和dNTP的使用量，添加甜菜碱和海藻糖等辅助因子，从而达到在保证有效扩增的前提下抑制从头DNA合成导致结果无法判定现象。本方法相应试剂盒含有上述反应试剂。本方法实现NEMA扩增结果的有效判定，消除从头DNA合成对反应产生的抑制作用，提高了等温扩增技术的可信度。且操作简单，成本低廉，可用于等温扩增检测手段中。

技术领域

本发明属于分子生物学等温检测领域，具体涉及一项抑制切克内切酶介导等温扩增从头DNA合成现象的方法。

背景技术

最早的从头合成的概念指的是生物体内用简单的前体物质合成生物分子的途径。通常大家熟知的是：游离的碱基和自由的核苷经过简单反应合成是核苷酸合成的主要来源，此过程称为重新利用(或者补救合成)途径(Salvage Pathway)。早在1948年，Buchanan等采用同位素示踪技术搞清楚了嘌呤核苷酸的在鸽子体内的合成过程，即为补救合成途径。然而，体内最主要的核苷酸合成途径是从头合成途径(de novo synthesis)：氨基酸、核糖核苷、一碳单位以及二氧化碳等简单物质做为原料合成核苷酸的复杂转变过程。

切刻内切酶具有高度的酶切活性，加上链置换活性强的Bst DNA聚合酶的参与，Nadezhda V.Zyrina等在2007年的实验中同时使用了该两种酶并提出了两种酶能够参与催化“de novo synthesis”的观点。研究中发现，当把N.BspD6I DNA切刻内切酶(-GAGTCNNNN-)加入到)加入到含有dNTP和Bst DNA大片段聚合酶的混合体系中时，即是不存在模板和引物的情况下，大量的DNA合成物也会产生。而且，N.BspD6I DNA切刻内切酶的活性同“从头DNA”的大量合成是呈正相关性的，在其最大活性值时，“从头DNA”的量达到最大浓度。电子显微镜数据显示，大多数从头合成的DNA分子有一个分支结构，而且包括大量短的重复序列，像是真核细胞中的随行DNA，这些序列显示了含有4-36bp的重复长度的准回文结构。实验通过合成片段的克隆和排序证实了从头合成的DNA产物主要是由多重的六核苷酸非回文串联重复结构构成，这个结构中包含有多处切刻内切酶的识别位点。一种可能的机理就是：dNTP原料依赖的DNA合成物是由N.BspD6I DNA切刻内切酶激发产生的。它来源于一个“消化-延长”的高效的指数扩增的循环：包含有多个限制性酶切位点的回文结构的DNA链被消化为短片段，这些短片段作为模板用于延伸出更长的DNA产物。

实验发现，在一种嗜热限制性内切酶(普遍为切刻内切酶)存在时，即使不添加任何的模板和引物核苷酸的情况下，嗜热的DNA聚合酶在恒温条件下便会高效合成和扩增DNA。1个小时内1Μ的DNA聚合酶能够合成超过10μg的DNA，而且这个反应会持续到可获得的dNTP消耗完为止。另有文章提出，Bst大片段DNA聚合酶在N.BspD61切刻内切酶和dNTP存在时表现出一种十分高效的模板依赖的DNA合成性。实验数据还表明，10Μ的N.BspD61切刻酶添加量条件下＞200bp的DNA产物主要是在1小时恒温中合成的，反而随着恒温时间的增长会导致短片段(＜200bp)的积累。“从头DNA”能够在55-75℃温度范围内合成，最佳温度范围是65-70℃。在较低温度时(＜60℃)，反应相对减慢而且合成的是较长的DNA分子(＞1knt)；在较高温度时(＞75℃)，少量的(或者是几乎没有)DNA合成。