[发明专利]一种大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关病毒和抗肿瘤应用

说明书

本发明公开了一种大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关病毒和抗肿瘤应用，属于基因工程技术领域。本发明的大鼠Kif11基因干扰shRNA，shRNA正义链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；shRNA反义链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。本发明还提供了含有大鼠Kif11基因干扰shRNA序列的重组腺相关病毒rAAV9‑ZsGreen‑ShRNA‑Kif11，病毒滴度高，每毫升含有1×10¹³病毒转导颗粒，能显著抑制肿瘤细胞Kif11基因表达，抑制肿瘤细胞增殖反应，在肿瘤治疗方面具有应用前景。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关病毒干扰载体和抗肿瘤应用。

背景技术

Kif11(kinesin family member 11，又称Eg5)是驱动蛋白家族成员之一，通常认为其在增殖组织细胞中高表达，定位于有丝分裂期的微管，是细胞分裂过程中染色体的定位、中心体的分离以及双极纺锤体的形成和分离的关键分子。随着Kif11抑制剂monastrol的发现，能够用于抗肿瘤的Kif11小分子抑制剂已经成为国际上众多制药公司的研发热点。有研究显示Kif11在非分裂的神经细胞中也有表达，与调节神经轴突的生长有关，但是否发挥其他功能尚未明确。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的一种生物学现象，能特异干扰靶基因的表达。其作用机制是：核糖核酸酶III家族的Dicer酶，与dsRNA结合，将其剪切成21-23nt及3’端突出的siRNA，随后siRNA与RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencing complex，RISC)结合，解旋成单链，活化的RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合到靶信使RNA(mRNA)上并将其切断，引发靶mRNA的特异性分解，能特异性阻断靶基因的表达。

目前人工实现RNAi的主要方法之一是直接将体外合成的siRNA序列导入细胞，主要缺点在于转染效率低，效果不稳定，作用持续时间短。另一种是通过转染载体持续稳定表达siRNA，主要优点在于稳定大量的表达短发夹RNA(shRNA)，shRNA末端在体内被加工、处理成约21bp的类siRNA分子，siRNA将启动RNAi因此可用于长时间干扰靶基因的表达。常用的载体包括腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)、逆转录病毒、慢病毒。与后两者相比，腺相关病毒AAV的突出优势在于安全性高，免疫原性低，宿主范围广，携带的转染基因能长期稳定表达，体外和体内均可应用，具有多种血清型，能满足针对不同组织的转染要求，具有广阔的应用范围和前景。

目前已经有针对Kif11的小干扰RNA产品，例如圣克鲁斯的生产的siRNA、shRNA质粒和慢病毒颗粒，但是靶基因针对小鼠Kif11，病毒滴度也不高，每毫升含有1×10⁶慢病毒转导颗粒。

发明内容

本发明的目的在于提供一种大鼠Kif11基因干扰shRNA及其重组腺相关病毒干扰载体和抗肿瘤应用。

本发明是通过以下技术方案来实现：

本发明公开了一种大鼠Kif11基因干扰shRNA，shRNA正义链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.1所示；shRNA反义链的核苷酸序列如SEQ.ID.NO.2所示。

本发明还公开了含有大鼠Kif11基因干扰shRNA序列的重组腺相关病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11。

该重组腺相关病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11为9型重组腺相关病毒。

本发明还公开了重组腺相关病毒rAAV9-ZsGreen-ShRNA-Kif11在制备抗肿瘤药物中的应用。