[发明专利]人类MTHFR和MTRR基因多态性检测引物和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体的，涉及人类MTHFR和MTRR基因多态性检测引物、探针和试剂盒。

背景技术

叶酸(Folic Acid)是指具有相关生物活性的一类同效水溶性B族维生素，其在机体内的活性形式为5-甲基四氢叶酸，为细胞生长和繁殖的必须物质，参与体内很多重要的代谢反应。作为体内一碳单位的传递体，叶酸参与嘌呤、胸腺嘧啶、核苷酸等多种物质的合成和转化，同时影响磷脂、肌酸、神经介质的生成，促进神经细胞与脑细胞发育。叶酸缺乏会导致高同型半胱氨酸血症，引起机体出现多系统损伤，是新生儿神经管缺陷，癌症、慢性萎缩性胃炎、结肠炎、肝细胞受损、血栓闭塞性心脏病、巨幼红细胞性贫血和白细胞减少症、抑郁症、动脉粥样硬化及其他心血管疾病的重要危险因素之一。

5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)能催化5,10-亚甲基四氢叶酸产生5-甲基四氢叶酸，参与甲基传递与核苷酸合成，是叶酸代谢过程中的关键酶。其基因位点突变对酶的活性和热稳定性产生影响，从而影响叶酸和甲硫氨酸代谢。该基因最常见的两个单核苷酸多态性677C>T和1298A>C，在中国发生率分别为45.2％和18.6％。MTHFR677C>T突变可造成其编码的氨基酸由丙氨酸变成缬氨酸，引起耐热性和酶活性下降，杂合MTHFR 677CT酶活性下降30％，纯合677TT酶活性下降65％以上，在低叶酸的环境下，纯合677TT可显著升高血浆同型氨酸浓度，从而引起静脉栓塞、肺栓塞、动脉粥样硬化、脑卒中等疾病，携带MTHFR 677TT基因型的母亲在低叶酸环境情况下生育神经管缺陷的病儿的风险也大大增加。MTHFR A1298C突变引起编码的氨基酸由谷氨酸转变为丙氨酸，也会导致酶活性下降，但下降程度比MTHFR C677T突变轻微，文献报道与高同型胱氨酸血症无直接关系，但与MTHFR C677T突变有协同效应。甲硫氨酸合成酶还原酶(MTRR)主要作用是将失活的甲硫氨酸合成酶还原为活性状态，维持甲基传递通路继续进行，使得体内的同型半胱氨酸保持在无毒水平。其报道最多的单核苷酸多态性是66A>G，中国人群发生率为25.7％，突变导致其酶活与同型半胱氨酸再甲基化速率降低，引起高同型半胱氨酸血症。MTHFR和MTRR基因多态性如表1所示。

表1：MTHFR和MTRR基因多态性

目前针对基因多态性的检测方法很多，如直接测序法，焦磷酸测序法，高分辨率溶解曲线检测法(High Resolution Melting Analysis，HRM)，荧光定量PCR法等。其中最常见方法为测序法，该方法费用较低，但操作耗时长且灵敏度低；高分辨率溶解曲线法对设备要求比较特殊，在临床推广存在一定的困难；传统荧光定量PCR法在临床上应用较为广泛，但该方法检测基因多态性一般采用Genotyping方法进行检测，该方法对样本数量以及多态性分布有一定要求，样本量少时不能对样本基因多态性进行准确检测。因此，需要建立一种快速有效的检测少量样本的MTHFR和MTRR基因多态性的方法。

发明内容

本发明的目的在于，克服现有技术中的不足，提供同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的特异性引物序列和试剂盒，以此解决现有基因多态性检测技术中，样本量少时基因多态性检测效果不理想的问题。

本发明提供了同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的特异性引物序列，所述特异性引物序列的核苷酸序列如SEQ ID No.1-9所示。

本发明还提供了一种用于同时检测人类MTHFR和MTRR基因多态性的检测试剂盒，其中，所述试剂盒中含有本发明所述的特异性引物序列。

所述检测试剂盒中还含有3组特异性探针，所述3组特异性探针的核苷酸序列分别为SEQ ID NO:10与SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:12与SEQ ID NO:13，SEQ ID NO:14与SEQ ID NO:15，且所述特异性探针的5’端修饰有FAM或VIC，3’端修饰有NFQ-MGB。