[发明专利]基于AFP抗原的AFP纳米抗体A65

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及特异性结合甲胎蛋白(Alpha-Fetal Protein，AFP)的纳米抗体(单域重链抗体，Variable domain of heavy chain of heavychain antibody,VHH)及其应用。

背景技术

甲胎蛋白是一种糖蛋白，由胎肝或成人肝脏产生，常见于在孕妇和婴儿的血液中，但在健康成人血液中含量很少，目前主要用于原发性肝癌的早期诊断、疗效评估和预后评价，是原发性肝癌(PHC)重要的血清学标志物。甲胎蛋白作为一种标志物在多种肿瘤中，尤其肝细胞癌(HCC)中有着过度表现。随着对AFP基因结构及功能的进一步深入研究，其在HCC的早期诊断及生物学治疗中越来越重要的作用。在其他肠胃管肿瘤如胰腺癌或肺癌及肝硬化等患者也出现不同程度的升高。当肝细胞发生癌变时，会产生这种AFP，而且随着病情恶化它在血清中的含量会急剧增加，甲胎蛋白就成了诊断原发性肝癌的一个特异性临床指标。

临床检测患者AFP的常规方法有放射性免疫法(RIA)，酶免疫法(EIA)和胶体金法，目前化学发光免疫检测技术(CLIA)因其具有反应快、灵敏度高、准确度高，标记物稳定、对人体无放射性或毒性危害且特异性强等特点，是目前为止公认最好的微量定量检测方法。在检测研究性实验当中，需要大量的抗体应用于新型的、高效的检测方法的研究。纳米抗体具备了特异的抗原结合能力及高亲和力，显示出了独特性质及在研究领域的巨大应用潜能。且抗体以及抗原标准品非常昂贵，而且有些毒素具有危险性。

发明内容

本发明利用噬菌体展示技术，从驼源免疫的单域重链抗体库中筛选能与靶分子(AFP抗原)特异性结合的单域重链抗体(VHH)噬菌体克隆，以VHH作为AFP抗体应用于免疫学分析检测领域。该方法筛选得到的VHH具有与AFP免疫反应特性，且特异性好、高亲和力，可应用于AFP的免疫学检测。本发明以AFP标准品为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，投入驼源免疫的单域重链抗体库进行亲和淘选，获得了一种抗AFP纳米抗体，具有SEQ ID NO.:1所示的氨基酸序列。其氨基酸序列的IMGT编号和结构域划分如图1所示。

本发明所提及的AFP纳米抗体(VHH)包括四个框架区(Framework region,FR)和三个互补决定区(Complementarity-determining region,CDR)。其中，框架区(FR1-FR4)分别选自SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.:4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:8，互补决定区(CDR1-CDR3)分别选自SEQ ID NO.:3，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:7。框架区结构相对保守，主要起着维持蛋白质结构的作用；互补决定区结构相对多样化，主要负责抗体的识别。

本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO.:2，SEQ ID NO.:4，SEQ ID NO.:6和SEQ ID NO.:8中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有90％同源性。

本发明提供一种蛋白质或多肽，包含SEQ ID NO.:3，SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:7中的一个或两个及以上的氨基酸序列，且至少与其中一个的氨基酸序列有80％同源性。

本发明还涉及编码AFP抗体氨基酸序列的核苷酸，其序列为SEQ ID NO.:9。

本发明提及的基于AFP结合的纳米抗体可通过噬菌体扩增或基因工程重组表达的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有AFP纳米抗体(VHH)的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有AFP的纳米抗体(VHH)的噬菌体粒子。基因工程重组表达的方式是指将编码纳米抗体的基因，通过克隆至表达载体，以蛋白表达的形式进行AFP抗体的大量制备。

本发明还涉及所述AFP纳米抗体在非疾病诊断治疗目的免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。

本发明AFP纳米抗体在应用时，可以通过噬菌体扩增获得的展示有AFP纳米抗体的噬菌体粒子直接用于分析检测以及将AFP纳米抗体经过原核生物或真核生物表达后以蛋白的形式进行免疫学检测分析。