[发明专利]一种次氯酸荧光比率探针及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种荧光比率探针及其应用，尤其涉及一种基于TBET(through bond energy transfer)机理的次氯酸荧光比率探针及其应用；属于有机小分子荧光探针领域。

背景技术

次氯酸是生物体内最重要的活性氧之一，在生物体内是由双氧水和氯离子经髓过氧化酶催化而成【A.Hammer et al,Lab.Invest.,2001,81,543】。一方面，次氯酸作为内源性杀菌剂在抵抗细菌入侵起着重要的作用[Z.M.Prokopowicz et al,Immunol.,2010,184,824]；另一方面，次氯酸生成量的失控与某些疾病有关，比如：关节炎、肾脏疾病、肺损伤、动脉硬化以及肿瘤等疾病[R.Rao et al,Front.Biosci.,2008,13,7210；D.I.Pattison et al,Biochemistry,2006,45,8152]。因此发展生物体内次氯酸成像技术对研究其在生理活动的作用具有重要的意义。

次氯酸荧光探针作为一种生物成像技术，因其具有高选择、超灵敏及快速响应等优点吸引了科学家的更多关注[H.Zhu et al,J.Am.Chem.Soc.,2014,136,12820；Q.A.Best et al,J.Am.Chem.Soc.,2013,135,13365]；荧光比率探针因其能够有效消除环境、探针浓度及激发光强度的干扰而备受青睐[L.Yuan et al,Acc.Chem.Res.,2013,46,1462]。在众多类荧光比率探针中，TBET机理的荧光比率探针是通过共轭键将能量供体荧光团与能量受体荧光团连接而成。因其能量传递是经过共轭键来完成并不需要供体发射峰与受体吸收峰的大量重叠，所以这类探针具有较高的能量传递效率，较大的pseudo-Stokes位移，进而提高了该类探针在成像中的分辨率。

尽管次氯酸荧光比率探针的报道很多，但是到目前为止基于TBET机理的次氯酸荧光比率探针尚属空白。因此开发基于TBET机理的次氯酸荧光比率探针成为目前亟待解决的课题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种基于TBET机理的次氯酸荧光比率探针及其应用。

本发明所述的基于TBET机理的次氯酸荧光比率探针，其特征在于所述荧光探针由罗丹明B硫代酰肼与6-二甲氨基-2-萘甲酰基相连接，形成单硫代双酰肼核心结构，其化学结构式如式(I)所示，

上述的基于TBET机理的次氯酸荧光比率探针的制备方法是：用已知方法合成6-二甲氨基-2-萘甲酰氯和罗丹明B硫代酰肼，然后二者反应得到上述次氯酸荧光比率探针。

上述的次氯酸荧光比率探针在检测含次氯酸样品中的应用。

其中：所述含次氯酸样品优选是生物细胞、含次氯酸的溶液。

本发明所述的探针的核心结构单硫代双酰肼与次氯酸发生反应生成噁二唑(见图1)，从而将两个荧光团用共轭键相连接，同时罗丹明B螺环打开，能量传递体系建立，导致萘蓝色荧光强度减弱罗丹明红色荧光增强；从而达到荧光比率检测次氯酸的效果。

具体的：配制上述氯酸荧光比率探针的乙醇与磷酸盐(0.05M)缓冲液(v/v＝3：7，pH＝6，)的溶液，分别加入定量的活性氧或活性氮的水溶液，如：t-BuOOH,t-BuOO·,H₂O₂,HO·,NO,NOOO^-,¹O₂,^-O₂,及HOCl。然后对上述溶液进行荧光测试，结果表明上述探针对次氯酸有很好的选择性，其在585nm与440nm处的荧光强度比值(I₅₈₅/I₄₄₀)变化明显，见图2，3。

在加入上述探针的RAW264.7活细胞中，对照不加LPS和加入LPS(LPS：细胞产生次氯酸的刺激剂)的细胞染色荧光显微成像变化。可以看出对照组A细胞蓝色通道荧光较强，红色通道荧光较弱；对照组B蓝色通道荧光较A组减弱，红色通道荧光较A组增强；其红色通道荧光与蓝色通道荧光强度统计值的比值变化非常明显，见图4。

本发明所述的荧光探针随次氯酸浓度的增加，585nm处荧光强度逐渐增强，440nm处荧光强度逐渐减弱；二者比值相对次氯酸浓度在一定范围内呈线性关系。所以该探针能够定量检测低浓度的HOCl。见图5。