[发明专利]固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料和蛋白质分离纯化技术领域，特别涉及一种固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备及其富集卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法。

背景技术

钙是人体中含量最多的微量元素，具有重要的生理功能，被称为人体的“环境卫士”。然而钙的缺乏和吸收效率低已成为当今的全球性问题，因此补钙已成为当务之急。卵黄高磷蛋白磷酸肽（PhosvitinPhosphopeptides，简称PPPs）是从卵黄高磷蛋白酶解物中提取的一种多种短肽的混合物，可促进钙、铁和锌等金属离子的吸收。而且大量的研究结果表明：相比于已商品化的补钙产品－酪蛋白磷酸肽（CaseinPhosphopeptides，简称CPPs），PPPs在抑制钙形成不溶性的化合物方面具有明显优势。因此可见，开发PPPs作为补钙产品具有广阔的应用潜力与实际研究、应用价值。

目前，可用于PPPs富集的方法主要有乙醇钙沉淀法，离子交换法和膜分离法。其中，乙醇钙沉淀法具有乙醇消耗量大，且溶剂残留；离子交换法操作复杂，且需要大量的酸液碱液再生，对环境会造成较大程度的污染；而膜分离法工序繁琐，对设备条件要求较高。因此，寻找一种高效、安全、成本低，工艺简单的PPPs富集方法具有重要的研究价值。

1975年Porath首先提出了固定化金属离子亲和色谱（Immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)，该技术主要是利用络合配基将金属离子固定在载体基质上，通过所固定的金属离子与目标蛋白质之间的配位作用进行吸附与分离。经过几十年的发展，目前已经成为最为普及的磷酸化肽富集方法。而随着磁性纳米技术的发展，将IMAC技术与磁性纳米技术相结合用于生物物质的分离纯化已成为当今研究的热点。其中四氧化三铁磁性纳米颗粒毒性较低，制备方法简单，当粒径小于30nm时，则表现出超顺磁性，即在外加磁场作用下具有较强的磁响应性，当撤离磁场时，磁性迅速消失，剩磁为零，不会被永久磁化。

到目前为止，尚未有采用壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒修饰Fe³⁺以制备固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒，并将其作为吸附载体用于PPPs富集的报道。本发明制备合成了形貌规整，粒径均一的超顺磁性固定化壳聚糖季铵盐金属离子纳米颗粒，并将其应用于蛋黄中PPPs的富集。

发明内容

本发明的目的在于提供一种超声波辅助化学共沉淀法制备固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的方法，制备所得的颗粒形貌规整、粒径均一、磁响应性强，具有良好的生物相容性。采用所制备的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒富集PPPs，操作简便、成本低廉，生产周期短，解决了传统PPPs富集困难、步骤繁琐等问题。

本发明提供的固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备及其富集PPPs的方法，具体实施方案如下：

1、固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备

采用超声波辅助的化学共沉淀法合成，其化学反应式为：

Fe²⁺+2Fe³⁺+8NH₃·H₂O=Fe₃O₄↓+8NH₄₊+4H₂O

固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备方法，按照下述步骤进行：

（1）将一定摩尔比例的可溶性Fe²⁺和Fe³⁺盐溶解在纯水溶液中，向其中加入表面活性剂，并通氮气30min，反应在超声波体系（F=28KHz）中进行；

（2）将温度升高到40～70℃，在超声波分散状态（F=28KHz）下缓慢滴加碱液到反应体系中,最终使pH值达到10～11，反应30min后继续向体系中加入一定量的浓度为1%的壳聚糖季铵盐溶液，之后将温度升高到80℃反应1～6h，终止反应，之后在外加磁场的作用下分离磁性颗粒，并且用去离子水清洗数次至中性，对收集到的磁性颗粒进行干燥处理，即可得壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒粉末，简写为MNPs。

红外光谱研究表明：壳聚糖季铵盐成功实现了对四氧化三铁的表面修饰，且壳聚糖季铵盐的修饰未对四氧化三铁磁性纳米颗粒粒径及水分散性质引起改变，因此，壳聚糖季铵盐磁性纳米颗粒也具有超顺磁性及良好的水分散性。

采用上述方法制备的MNPs磁性纳米颗粒形貌规整，粒径均一，平均粒径在15～20nm左右，具有超顺磁性，同时在水溶液中具有良好的分散性。