[发明专利]一种人源星形胶质前体细胞的制备方法及培养基

说明书

本发明公开了一种人源星形胶质前体细胞的制备方法及培养基。通过本发明的方法，可以在体外获得大量的星形胶质前体细胞，与由神经干细胞直接分化星形胶质细胞的传统方法相比，本发明获得的前体细胞具有强增殖能力以及定向分化为星形胶质细胞的能力，短期内能迅速得到大量高纯度的星形胶质细胞；用于培养星形前体细胞的培养基具有成分确定，商品可得的特点；用于大量产生用于科研或者临床的星形细胞的手段具有成本低廉、安全性高、生产效率高、可操作性强的特点。

技术领域

本发明属于生物医学领域，涉及一种应用诱导多能干细胞技术制备人源星形胶质前体细胞的方法及培养基。具体涉及诱导人源诱导多能干细胞(induced pluripotentstem cell,iPSC)分化为大脑星形胶质前体细胞(Astrocyte progenitor cell)的方法。

背景技术

星形胶质细胞(Astrocyte)是哺乳动物脑内分布最多的一类细胞，此类胶质细胞呈星形，从胞体发出许多长的突起，突起与神经细胞相接触，起支持和分隔神经细胞的功能。应用诱导多能干细胞分化获得星形胶质细胞的技术不仅推进神经科学研究的进步，而且为大量获取星形胶质细胞来源应用于临床提供基本条件。星形胶质细胞最早是由人源诱导多能干细胞，经过神经前体细胞的分化步骤而获得(图1)。

人源星形胶质前体细胞的维持培养，需要应用特定的培养基以维持其前体细胞属性。目前有关人源星形胶质前体细胞的报导少之又少，大部分有关星形胶质前体细胞的报道都是来源于大鼠或小鼠，科学家只能通过分离人脑部组织，通过原代培养和鉴定获得，组织来源有限，获得细胞数目不多。能查到的文章中提到的有关人源星形胶质前体细胞是这样获得的：购买人神经前体细胞系(该细胞系是商品)，经过培养(培养基为人神经前体细胞培养基ScienCell Research Laboratories)混合1％胎牛血清，20天后，即可获得CD44阳性的细胞，CD44是星形胶质前体细胞的标志物，故该细胞为星形胶质前体细胞。利用流式细胞仪，可以将这些CD44阳性细胞回收，纯化和培养(人神经前体细胞培养基ScienCellResearch Laboratories混合1％胎牛血清)的。这些前体细胞的分化产物是星形胶质细胞，是为神经元提供营养与支持的，如果星形胶质细胞功能受损，也会导致重大疾病如阿尔茨海默病。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种人源星形胶质前体细胞的制备方法及培养基。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述人源星形胶质前体细胞的制备方法包括如下步骤：

(1)将诱导多能干细胞接种于细胞专用培养板中，采用mTeSR干细胞培养基、于37℃条件下对诱导多能干细胞进行培养，每隔6—8天，优选7天传代一次，每天更换新鲜的mTeSR干细胞培养基；

(2)诱导多能干细胞传代第5天后，用无菌的PBS缓冲液润洗细胞表面，然后加入少量(相当于更换的新鲜的mTeSR干细胞培养基一半体积)拟胚体分化培养基(该拟胚体分化培养基为现有技术)；用无菌细胞刮子轻刮诱导多能干细胞细胞团边缘，使诱导多能干细胞细胞团脱离培养板并处于悬浮状态，然后反复吹打使诱导多能干细胞细胞团分散，将分散后的诱导多能干细胞细胞团转移至细胞培养皿，补加拟胚体分化培养基后在37℃条件下震荡培养5天以上，每2天更换一次新鲜的拟胚体分化培养基；