[发明专利]环氧基磁性纳米硅球的制备方法及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及纳米材料和蛋白质分离纯化技术领域，特别涉及一种固定化金属离子亲和磁性纳米颗粒的制备及其富集卵黄高磷蛋白磷酸肽的方法。

背景技术

卵黄高磷蛋白磷酸肽（PhosvitinPhosphopeptides，简称PPPs）是从卵黄高磷蛋白酶解物中提取的一种多种短肽的混合物，可促进钙、铁、锌等金属离子的吸收。而其中，钙是人体中含量最多的微量元素，具有重要的生理功能，被称为人体的“环境卫士”。然而钙的缺乏和吸收效率低已成为当今的全球性问题，因此补钙已成为当务之急。迄今为止，大量的研究结果表明：相比于已商品化的补钙产品－酪蛋白磷酸肽（CaseinPhosphopeptides，简称CPPs），PPPs在抑制钙形成不溶性的化合物方面具有明显优势。因此可见，开发PPPs作为补钙产品具有重要的实际研究价值。

目前，可用于PPPs富集的方法主要有乙醇钙沉淀法，离子交换法和膜分离法。其中，乙醇钙沉淀法具有乙醇消耗量大，且溶剂残留；离子交换法操作复杂，且需要大量的酸液碱液再生，对环境会造成较大程度的污染；而膜分离法工序繁琐，对设备条件要求较高。因此，寻找一种高效、安全、成本低，工艺简单的PPPs富集方法具有重要的研究价值。

针对上述方法存在的技术关键问题，本发明引进磁性纳米分离技术。磁性纳米分离技术是以磁性纳米载体为依托的高新分离技术，当颗粒的粒径小于30nm时，则具有超顺磁性，称为超顺磁性纳米颗粒；超顺磁性纳米颗粒具有较强的磁响应性，在外加磁场的作用下，磁性颗粒可以快速富集、定位，当外加磁场消失后，颗粒的磁性也随即快速消失，目前已在生物医药、生物技术、化学、环境治理等领域得到了广泛的应用，成为当今最富有发展前景的新型分离技术之一。目前，磁性载体材料是近年来发展起来的用于生物活性成分分离纯化的新型载体材料，与非磁性载体材料相比，以磁性材料作为分离介质可以使待分离的生物活性成分容易从反应体系中分离、回收，并可在外加磁场的作用下实现高效分离，解决了传统机械搅拌对生物活性成分活性降低的局限。

固定化金属离子亲和色谱（Immobilizedmetalaffinitychromatography，IMAC)主要是通过所固定的金属离子与目标蛋白质之间的配位作用进行吸附与分离，经过几十年的发展，目前已经成为最为普及的磷酸化肽富集方法。本发明就是利用Fe³⁺对磷酸肽所具有的特定吸附作用，将磁性纳米分离技术与IMAC相结合制备得到了固定化金属离子亲和磁性纳米材料，并将其应用于蛋黄中PPPs的富集。目前固定化金属离子亲和磁性纳米材料在PPPs的富集工艺中未见报道。本发明采用Fe³⁺对环氧基化磁性纳米硅球进行表面功能化修饰，赋予其特异性分离目标组分的功能，且制备所得的磁性纳米载体可实现重复利用，大大降低了工业化生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种双表面活性剂修饰的磁性纳米颗粒的制备方法，制备所得的颗粒形貌规整、粒径均一、磁响应性强，具有良好的生物相容性。采用所制备的环氧基磁性纳米颗粒富集PPPs，操作简便、成本低廉，生产周期短，解决了传统PPPs富集困难、步骤繁琐等问题。

本发明的方法具体按照下述步骤进行：

1、环氧基磁性纳米硅球的制备方法，按照下述步骤进行：

（1）双表面活性剂修饰Fe₃O₄磁性纳米颗粒的制备：将一定摩尔比例的Fe²⁺、Fe³⁺盐和PEG6000溶解在体积比1:1～10:1的纯水－无水乙醇的混合溶液中，控制体系温度为40～70℃，除氧30min，整个反应在机械搅拌下进行；之后缓慢滴加碱液到反应体系中，使体系pH值达到10～11，搅拌反应30min后加入另外一种表面活性剂（与Fe³⁺的摩尔比为1：1），随即将反应温度迅速升高到70～90℃，继续反应1～6h，终止反应，并在外加磁场的作用下快速分离出磁性颗粒，用去离子水清洗数次以去除未反应完全的化学物质，直至最后溶液的pH在7左右。收集黑色颗粒，并进行冷冻干燥，备用。