[发明专利]一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体涉及一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法。

背景技术

Nrf2蛋白是细胞内的一种转录因子，控制基因的表达。Nrf2在细胞受到外界有害刺激后被激活，激活的Nrf2增加多种细胞内保护因子的基因表达水平，产生细胞保护效应，抑制细胞的损伤。

利用小分子化合物(药物)作为Nrf2的激活剂，在没有外界有害刺激的情况下通过药物作用激活Nrf2，起到细胞保护作用，是目前新药研发的一个方向。目前国外开发的小分子Nrf2激活剂有些已经进入临床研究阶段。

在新药开发的前期阶段，需要从众多的化合物中筛选具有Nrf2激活作用的化合物。目前常用的研究方法包括：

(1)用分子生物学方法检测Nrf2靶基因的表达水平(如：TanKP,YangM,ItoS:Activationofnuclearfactor(erythroid-2like)factor2bytoxicbileacidsprovokesadaptivedefenseresponsestoenhancecellsurvivalattheemergenceofoxidativestress.MolPharmacol2007,72(5):1380-1390.)。主要缺点：实验步骤复杂，无法满足高通量(高效率)筛选的需要；结果随机误差大。

(2)用生物化学方法检测Nrf2靶基因(主要是NAD(P)H:醌氧化还原酶-1)的功能活性(如：Dinkova-KostovaAT,LibyKT,StephensonKK,HoltzclawWD,GaoX,SuhN,WilliamsC,RisingsongR,HondaT,GribbleGWetal:Extremelypotenttriterpenoidinducersofthephase2response:correlationsofprotectionagainstoxidantandinflammatorystress.ProcNatlAcadSciUSA2005,102(12):4584-4589.)。主要缺点：实验结果不能直接反映Nrf2的功能活性，特异性较差；较难实现高通量筛选。

(3)用生物化学的方法检测Nrf2蛋白在细胞中的积累水平(如：WondrakGT,CabelloCM,VilleneuveNF,ZhangS,LeyS,LiY,SunZ,ZhangDD:Cinnamoyl-basedNrf2-activatorstargetinghumanskincellphoto-oxidativestress.FreeRadicBiolMed2008,45(4):385-395.)。主要缺点：无法满足高通量筛选的需要。

(4)在细胞中瞬时表达带有Nrf2结合位点的报告基因，检测Nrf2增强基因表达的功能水平(WondrakGT,CabelloCM,VilleneuveNF,ZhangS,LeyS,LiY,SunZ,ZhangDD:Cinnamoyl-basedNrf2-activatorstargetinghumanskincellphoto-oxidativestress.FreeRadicBiolMed2008,45(4):385-395.)。此方法与其他方法相比主要的优点是检测数据能够直接反映Nrf2的转录因子功能活性。主要缺点：无法满足高通量筛选的需要。

发明内容

本发明的目的就是提供一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法，步骤如下：

(1)构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因；

(2)将报告基因插入到pGL4.26[luc2/minP/Hygro]质粒当中，得到报告基因质粒；

(3)用大肠杆菌(或感受态DH5α菌株)将报告基因质粒扩增并提纯质粒；

(4)用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞。

稳定转染后是否能得到反应性良好的细胞株取决于所用的报告基因DNA序列，所用的质粒系统和所用的细胞之间的组合效果，最终的结果无法预测，只能通过实验确定最终产品是否可用。本发明用pGL4.26[luc2/minP/Hygro]质粒和HeLa细胞搭配制备得到的稳定表达细胞株，经过用已知的Nrf2激活物刺激细胞和用Nrf2基因沉默(抑制原有Nrf2的活性)正反两种方法，均证实具有能满足试验需要的敏感性和特异性。