[发明专利]半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法

权利要求书

1.一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于，包含如下步骤：

步骤一：小麦籽粒DNA的提取

a.切取1/3～1/2粒小麦种子，研磨，加入DNA提取缓冲液，水浴，每隔5分钟上下颠倒 1次；冷却至室温，离心；

b.取上清液加入醋酸铵和乙醇，上下充分颠倒，离心；

c.弃上清液，加入乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，离心；

d.弃上清液，于室温下充分干燥；

e.加双蒸水溶解DNA；

步骤二：高分子量谷蛋白亚基的PCR反应

5亚基的引物序列为：

P₁5′-GCCTAGCAACCTTCACAATC-3′，P₂5′-GAAACCTGCTGCGGACAAG-3′；

10亚基的引物序列为：

P₃5′-GTTGGCCGGTCGGCTGCCATG-3′，P₄5′-TGGAGAAGTTGGATAGTACC-3′；

PCR反应体系为25μL，含1μL提取的DNA，1×Buffer，2mmol/LMgCl₂，每种dNTP 各为0.8mmol/L，每种引物各为0.2μmol/L，Taq酶1.5U；

PCR反应条件为：95℃预变性3min，94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸45s～ 1min，35个循环，最后72℃再延伸5min；

步骤三：高分子量谷蛋白亚基的SDS-PAGE电泳及检测

经PCR检测出为5+10亚基纯合体的籽粒后，选取步骤一中a小步骤中与所述PCR检测出为5+10亚基纯合体编号对应的离心后的沉淀物，10000rpm离心2min，弃上清液，加入300μL 蛋白质提取液，于高通量组织研磨仪上震荡30s，再沸水浴10min，取出冷却至室温，10000 rpm离心10min，取上清液；

高分子量谷蛋白亚基的检测：采用不连续SDS-PAGE电泳，浓缩胶浓度为3%，分离胶 浓度为8%，交联度为3.33%。

2.如权利要求1所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于， 所述步骤一具体为：

a.用干净刀片切取1/3～1/2粒小麦种子，放入1.5mL离心管中，同时放入1粒直径为4.0 mm的钢珠，于高通量组织研磨仪上1500rpm研磨3min，加入700μLDNA提取缓冲液，65℃ 水浴约30min，其间每隔5分钟上下颠倒1次；冷却至室温，13000rpm离心15min；

b.取500μL上清液于一新的1.5mL离心管中，加入50μL10mol/L醋酸铵和1mL95%乙 醇，上下充分颠倒，13000rpm离心10min；

c.弃上清液，加入1mL70%乙醇，上下缓慢颠倒7～8次，13000rpm离心2min；

d. 弃上清液,于室温下充分干燥；

e.加30μL双蒸水溶解DNA。

3.如权利要求2所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于， 所述DNA提取缓冲液为：100mmol/L Tris-HCl pH8.0， 50mmol/L EDTA，500mmol/L NaCl。

4.如权利要求3所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于， 所述蛋白质提取液为：70mmol/L Tris-HCl，2%(V/V)β-巯基乙醇，2%(W/V)SDS，20%(V/V) 甘油，0.005%(W/V)溴酚兰。

5.如权利要求4所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于， 所述步骤二中退火后，72℃条件下，5亚基延伸45s，10亚基延伸1min。

6.如权利要求4所述的一种半粒法鉴定小麦高分子量谷蛋白亚基的方法，其特征在于， 所述步骤二中：1×Buffer为10mmol/L Tris-HCl，pH=8.3，50mmol/L KCl。