[发明专利]对克雷伯菌K44，K59，K61和K63特异的核苷酸及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及对克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特异的核苷酸，尤其涉及对克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型K抗原基因簇中单个基因特异的核苷酸及其应用。

背景技术

克雷伯氏菌为肠杆菌科中一类有荚膜的革兰氏阴性杆菌，在人类呼吸道、肠道、动物肠道中最为常见。常常引起人类的多种疾病，尤其是肺炎克雷伯氏菌；也是自然界水和土壤中的机会致病菌。其中肺炎克雷伯氏菌(又称肺炎杆菌)、臭鼻克雷伯氏菌和鼻硬结克雷伯氏菌与人类关系最为密切，尤其是肺炎克雷伯氏菌，它们所导致的疾病占所有克雷伯氏菌属感染的95％以上。

细菌分型与鉴定方法主要有传统的表型方法、血清学方法以及分子鉴定方法。然而，随着分子生物学的发展，传统的血清分型和鉴定方法存在着一定的问题，如血清分型这种诊断方法需要大量的抗血清，而抗血清一般种类不全，数量不足，大量的抗血清在制备和储存中也存在一些困难。另一方面血清分型方法耗时长、灵敏度低、漏检率高、准确性差，不同的K抗原产生的抗血清之间经常存在交叉反应。因此，建立基于分子生物学技术的血清鉴定方法成为发展方向。

克雷伯氏菌的表面抗原，既有O抗原也有K抗原，但是主要用K抗原进行分型，并且K抗原研究的比较透彻。在克雷伯氏菌所有K抗原中，共描述了82种，但是只有77种组成了国际上识别荚膜抗原机制的基础。尽管克雷伯氏菌也有12种O抗原，但是因为耐热的荚膜多糖的存在，很难测定它们的结构并加以区分。相反，K抗原产量高，并且可以区分大部分的临床分离菌株。由于高度的可区分性以及重复性，这种分类方法一直是研究菌株间流行病学关系的首选方法，并且在比对来自不同地方不同时间的菌株方面尤为有用。对于其分子鉴定也越来越受到人们的重视，分子生物学检测技术具有速度快且易于大规模使用的优点，是目前国际上公认的致病菌检测的发展方向。

近年来，越来越多的分子技术用于病原菌的分型、鉴定、检测及病害诊断，包括转录间隔区(ITS)序列分析、随机扩增长度多态性(RAPD)分析、核糖体DNA限制性片段长度多态性(RFLP)分析等。分子生物学方法不仅可用于克雷伯菌的快速血清分型筛查，稳定的鉴定结果可以弥补表型特征鉴定方法的不足。和传统检测技术相比，这些基于多聚酶链式反应(PCR)的分子检测技术，不需要经过病原菌的分离、纯培养等过程，而且具有快速、灵敏、特异性强等优点。

聚合酶链式反应技术(Polymerasechainreaction,简称PCR技术)作为微生物检测技术目前正在得到认同和推广，该技术相对于传统的方法有高通量、检测速度快、特异性强、灵敏度高等优点，只需对样品进行简单的预增菌或增菌过程，再通过离心及裂解制备细菌DNA模板，就可以在高特异性引物介导下的PCR过程中扩增目标序列，达到检测样品中是否含有待测的致病性微生物的目的。PCR的扩增过程仅需1个半小时。这对检验检疫部门和临床检验无疑极大提高了工作速度和降低了工作成本。

发明内容

本发明的目的在于提供了本发明涉及对克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特异的核苷酸，其特征在于所述的核苷酸具有：

1）SEQIDNO:1-8所示的核苷酸中的至少一种；

2）与SEQIDNO:1-8所示的核苷酸互补的核苷酸中的至少一种；所述的SEQIDNO:1-8如下：

本发明还提供了一种PCR试剂盒，包括PCR引物、dNTP、缓冲液和DNA聚合酶，所述PCR引物为如SEQIDNO:1-4所示的核苷酸中的至少一种。所述的试剂盒，还包括如下试剂：10mMdNTP30μl；10×酶特异性反应缓冲液50μl；5U/μl耐热DNA聚合酶5μl；引物混合物10μl；阳性对照品10μl；阴性对照品10μl；ddH₂O5ml。

其中所述的PCR引物优选为所述如SEQIDNO:1-14所示的核苷酸中的至少一种。

本发明进一步公开了对克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型特异的SEQIDNO:1-14核苷酸在制备用于检测克雷伯菌K44，K59，K61和K63血清型的PCR试剂盒。

本发明所述克雷伯菌指的是取样于腹泻大便、尿道感染、伤口和脑膜炎标本培养物的粗提液或是克雷伯菌的纯培养物的粗提液。收集克雷伯菌提取基因组是采用常规方法制备获得。

针对克雷伯菌的PCR试剂盒，整个检测步骤包括样品预处理—扩增—电泳检测结果。引物和PCR反应体系所需要的试剂已预先加入扩增管中，使用者只需将预处理后的样本加入扩增管启动扩增反应即可，简单快速的完成检测工作。