[发明专利]一种辅酶再生系统及其制备方法

权利要求书

1.一种辅酶再生系统，其特征在于，所述辅酶再生系统包括甲酸脱氢酶(formatedehydrogenase，FDH)、亮氨酸脱氢酶(leucine dehydrogenase，LDH)和甲酸铵以及磷酸吡哆醛，所述辅酶再生系统中的甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶来自基因工程菌发酵液，所述基因工程菌同时表达甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶，所述基因工程菌中具有质粒pFDH-pET28a和质粒pLDH-pET21a，所述辅酶再生系统由包括下列步骤的方法制备：

(1)甲酸脱氢酶和亮氨酸脱氢酶的异源表达

构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌，经发酵制得含FDH和LDH的酶液，包括下列步骤：

(a)构建FDH载体

将FDH基因连入使用核酸内切酶NdeⅠ和XhoⅠ双酶切的pET28a载体，构建得到重组表达FDH的质粒pFDH-pET28a；

(b)构建LDH载体

将LDH基因连入使用核酸内切酶XhoⅠ和NdeⅠ双酶切的pET21a载体，构建得到重组表达质粒pLDH-pET21a；

(c)构建同时表达FDH和LDH的基因工程菌

将质粒pFDH-pET28a和质粒pLDH-pET21a共转入E.coli BL21(DE3)，得到共表达FDH与LDH的菌株E.coli BL21-FDH/LDH；

(d)发酵所述菌株E.coli BL21-FDH/LDH，制备所述含FDH和LDH的酶液

将共表达菌株E.coli BL21-FDH/LDH在含Amp和Kan的LB液体培养基中培养，加入IPTG至终浓度为0.01～0.05mmol/L，16～27℃诱导表达12～20h，发酵液经菌体破壁后离心取上清即得所述FDH/LDH共表达酶液；

(2)配制辅酶再生系统

在缓冲液中配制辅酶再生系统，所述辅酶再生系统包括：所述含FDH和LDH的酶液、甲酸铵、NAD⁺、和磷酸吡哆醛。

2.根据权利要求1所述的辅酶再生系统，其特征在于，所述的辅酶再生系统还包括NADH。

3.根据权利要求1所述的辅酶再生系统，其特征在于，所述步骤(a)中以假丝酵母总DNA为模板，分别以上下游引物进行PCR扩增，从而获得所述FDH基因，其中：

上游引物为5’-AAACATATGAAAATCGTTCTCGTTTTGTACTCC-3’，其中，划线处为NdeI酶切位点；下游引物为5’-AAACTCGAGTGCGACCTTTTTGTCATTAC-3’，其中，划线处为XhoI酶切位点。

4.根据权利要求1所述的辅酶再生系统，其特征在于，加入IPTG至终浓度为0.02mmol/L，22℃诱导表达16h，发酵液经菌体破壁后离心取上清即得所述FDH/LDH共表达酶液。