[发明专利]一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法

权利要求书

1.一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于它按以下步骤实现：

一、称取鱼肌肉组织0.8mg，放入离心管中，加入400μL4℃预冷的PBS，用科弯剪剪成糜状，然后用匀浆器研磨，过100目筛网，再用2mL的PBS冲洗并滤去碎组织，取400μL滤液，置于离心管待用，获得细胞悬液；步骤一的操作全程于0～4℃下进行；

二、彗星实验采用双层凝胶结构，双层凝胶制备好后，将载玻片放置在4℃冰箱中0.8～1.2h，然后放入4℃预冷的新配制细胞裂解液中，4℃下避光裂解1.5h；

三、裂解后将载玻片取出，用双蒸水冲洗，然后放入盛有4℃的新配制电泳缓冲液的水平电泳槽中静止30min，再在4℃，300mA，0.7V/cm的条件下电泳20min；

四、电泳结束后将载玻片用去离子水冲洗3次，晾干后移去盖玻片，将载玻片用50μlEB染液染色15～20min，然后用双蒸水清洗，盖上盖玻片，用荧光显微镜观察彗星图像，在100倍荧光显微镜下随机选取8～12个清晰细胞核图像进行观察并用CCD拍摄彗星图像，然后计算细胞受损率或用casp软件分析图像，再使用spss统计软件分析结果，即完成鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验。

2.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤一中鱼肌肉取自鲤科鱼类胸腔背部、侧线与背鳍间肌肉。

3.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤一中的操作全程于2℃下进行。

4.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤一中PBS的浓度为0.01mol/L，pH为7.2～7。

5.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤二中细胞裂解液的配制：2.5mol/LNaCl、100mmol/LNa₂EDTA、10mmol/LTris、临用前加10％DMSO和1％TritonX-100。

6.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤二中将载玻片放置在4℃冰箱中1h。

7.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤二中双层凝胶的制备方法如下：

(1)取45mg正常熔点琼脂糖溶于6mLPBS，微波炉加热使其充分溶解，制备成0.75％正常熔点琼脂糖溶液，然后浇注到磨砂载玻片上，盖上盖玻片并于室温下贮存至琼脂糖凝固，移去盖玻片，获得第一层琼脂糖；

(2)取10mg低熔点琼脂糖溶于2mLPBS，微波炉稍加热使其充分溶解，制备成0.5％低熔点琼脂糖溶液，待温度降至35～38℃，取400μL细胞悬液与其混匀，然后将所得混合液加到第一层琼脂糖上，盖上盖玻片，即完成双层凝胶的制备。

8.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤三中电泳缓冲液的配制：1mmol/LNa₂EDTA和300mmol/LNaOH。

9.根据权利要求1所述的一种鱼类肌肉组织细胞基因损伤检测的彗星实验方法，其特征在于步骤四中EB染液的浓度为2μg/ml。