[发明专利]一种小脑脱细胞再生生物支架及其制备方法和用途

权利要求书

1.一种小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，其由脱去细胞的小脑组织的细胞外基质(extracellular matrix,ECM)构成，呈三维网状结构，其空间构型符合小脑生理结构空间构型。

2.按权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，所述的小脑组织选自健康成年C57BL/6小鼠。

3.按权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架，其特征在于，所述的再生生物支架是去除细胞后含有多种神经营养因子的小脑细胞外基质再生生物支架。

4.制备权利要求1所述的小脑脱细胞再生生物支架的方法：其特征在于，其包括下述步骤：

1，小脑再生支架的制备及鉴定，其中包括：

1)小脑取材

将获得的健康成年C57BL/6小鼠小脑组织，分离并去除所有的非中枢神经组织；

2)小鼠小脑脱细胞，

按下述顺序搅拌水浴过程脱细胞：1.0％SDS，去离子水，0.02％胰蛋白酶/0.05％EDTA，去离子水，1.0％Triton X-100，1.0M蔗糖，去离子水；脱去细胞的小脑组织浸没在青霉素G，链霉素以及两性霉素B的PBS中保存72h，制得小脑脱细胞再生生物支架，4℃PBS中保存备用；

3)支架的大体形态观察

以正常小鼠小脑为对照，观察小鼠小脑脱细胞支架的外形、颜色等变化情况；

4)小脑支架的组织学观察与评价

以正常小脑组织为对照，光镜下观察小脑脱细胞支架基质结构完整性、脱细胞程度及蛋白残留量；

5)再生生物支架残留DNA定量和片段长度分析

对残余DNA的含量和碱基对长度进行定量测定，其中，采用美国Invitrogen公司的Quant-iT PicoGreen dsDNA检测试剂盒检测提取的DNA含量，按PicoGreen dsDNA检测试剂盒说明书操作，1％琼脂糖凝胶电泳对残余DNA的碱基对长度进行测定；采用以下标准评价脱细胞的效果：(1)在DAPI和H&E切片上没有可见的细胞核；(2)DNA片段长 度不超过200bp；(3)双链DNA的含量小于50ng/mg干燥ECM，为符合再生生物支架要求；

6)BDNF和NGF含量测定

采用酶联免疫吸附试验(ELISA)对脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)的含量进行测定；

2，体外生物相容性试验，包括：

1)小脑再生支架ECM对NSCs的细胞毒性作用试验；

2)小脑再生支架ECM对NSCs的增殖作用试验；

3)小脑再生支架ECM对NSCs的迁移作用试验：

4)小脑再生支架ECM对NSCs的分化作用试验；

3，小脑脱细胞支架的扫描电镜观察，采用扫描电镜观察支架的结构；

4，体内生物相容性试验，包括：

1)动物分组：

SD大鼠随机分为皮下组及颅内组，各组平均分为三个亚组：假手术组，明胶海绵组及小脑再生支架组；

2)标本组织学观察

移植后标本经多聚甲醛固定、脱水、石蜡包埋、切片，分别进行HE染色，光镜观察；免疫组化染色，检测CD4⁺和CD8⁺T淋巴细胞浸润数目用于评价支架的免疫原性。

5.权利要求1,2或3所述的小脑脱细胞再生生物支架在用于制备治疗神经损伤后神经修复制剂中的用途。