[发明专利]一株高效转化L-天冬氨酸生产L-天冬酰胺的工程菌及其应用

说明书

本发明涉及一株用于生产l‑天冬酰胺的基因工程菌CICC 11034S，宿主为大肠埃希氏菌BL21(DE3)（Escherichia coli BL21(DE3)），含有来源于大肠埃希氏菌JM109（Escherichia coli JM109）的l‑天冬酰胺合成酶基因的表达载体。利用构建的工程菌全细胞高密度催化，可以高效转化l‑天冬氨酸生产l‑天冬酰胺，转化率为95.8%，l‑天冬酰胺产量可达126.5 g/L，生产速率为15.81 g/(L·h)，底物廉价，生产过程简便，副产物少，有效降低生产成本，具有很好的应用价值和可观的经济效益。

技术领域

本发明涉及一株基因工程菌及其应用，以L-天冬氨酸和氨水为底物转化生产L-天冬酰胺，属于生物工程技术领域。

背景技术

L-天冬酰胺，又名天门冬酰胺、天门冬素、α-氨基丁二酸一酰胺（L-Asparagine，L-Asn），在食品、医药、化工合成等行业得到广泛应用。

在食品领域，L-天冬酰胺作为添加剂，与糖共热进行氨基-羰基反应，能形成特殊香味物质。用于清凉饮料。在医药行业，可以用于氨基酸输液及降压、平喘、抗消化性溃疡、胃功能障碍等，在生命科学领域研究中，常用于治疗心肌梗死、心肌代谢障碍、心力衰竭、心脏传导阻滞、疲劳等症，在微生物培养中也有添加。工业领域L-天冬酰胺可以用于医药中间体及化工原料进行合成化工，也可用于丙烯腈的污水处理等。

目前，L-天冬酰胺的制备方法主要是提取法和化学合成法。直接提取方法主要是从L-天冬酰胺含量高的羽扇豆和大豆的豆芽的水提取物分离而得，以白羽扇豆为原料，经发芽、成浆、加热处理等流程，在pH小于6的条件下，经硅藻土过滤、离心，获得粗品，随后经过浓缩、结晶获得成品，该方法受原材料质量因素影响大，并且工艺复杂不易控制，污染严重；化学合成法主要通过L-天冬氨酸与氢氧化铵进行酰胺化而得，化学方法存在普遍的污染大、副反应多等缺陷。

生物转化法在天冬酰胺生产领域的应用鲜有报道，虽然该方法具有反应条件温和、生产效率高、副产物少等优点，同时对设备的要求低、投资小、生产过程简单，易于操作控制，但是由于酶法催化过程需要ATP的参与，因ATP价格昂贵限制了生物转化法的应用，目前未进入产业化阶段。

发明内容

本发明提供一株可以表达L-天冬酰胺合成酶的基因工程菌株CICC 11034S，利用菌体细胞ATP再生体系，转化L-天冬氨酸和氨水生产L-天冬酰胺，以替代现有L-天冬酰胺生产工艺，实现绿色生产。

本发明成功实现了将asnA基因在E. coli BL21(DE3)宿主菌中的高效表达，并以此基因工程菌株转化L-天冬氨酸和氨水生产L-天冬酰胺，具有原料成本低、生产过程简易、简便高效等特点（附图1）。

本发明底物L-天冬氨酸及产物L-天冬酰胺的定量测定分析采用柱前衍生-高效液相色谱方法（Hender JW, et al., Rapid, accurate, sensitive and reproducibleHPLC analysis of amino acids. Agilent Technologies. USA. 2000）。

本发明具有的突出特点是：

（1）本发明通过菌体细胞的ATP再生系统为反应提供ATP，有效降低了原料的成本。

（2）本发明方法构建的基因工程菌生产L-天冬酰胺的过程简便，易于操作。

（3）本发明的基因工程菌生产L-天冬酰胺，转化率为95.8%，产量可达126.5 g/L，生产速率15.81 g/(L·h)。