[发明专利]一种快速高效的曼陀罗原生质体制备方法有效
| 申请号： | 201510445685.5 | 申请日： | 2015-07-27 |
| 公开（公告）号： | CN105018412B | 公开（公告）日： | 2018-10-09 |
| 发明（设计）人： | 李卿;陈万生;肖玲;陈军峰;谭何新;肖莹;张磊 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军第二军医大学 |
| 主分类号： | C12N5/04 | 分类号： | C12N5/04 |
| 代理公司： | 上海元一成知识产权代理事务所(普通合伙) 31268 | 代理人： | 赵青 |
| 地址： | 200433 *** | 国省代码： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 曼陀罗 原生质体制 原生质体 组培苗 蔗糖密度梯度离心 植物细胞工程 细胞膜完整 技术获得 茎尖组织 起始材料 纤维素酶 幼叶组织 离析酶 叶绿体 富含 酶解 幼叶 消化 研究 | ||
1.一种曼陀罗原生质体制备方法，其特征在于，利用茎尖组织培养技术获得了无菌的曼陀罗组培苗，以曼陀罗组培苗的幼叶为起始材料，采用纤维素酶R10和离析酶R10，对曼陀罗幼叶组织进行酶解消化，并利用蔗糖密度梯度离心方法分离获得曼陀罗原生质体，具体的步骤如下：
(a)曼陀罗茎尖培养：剪取曼陀罗栽培苗的茎尖带幼芽部位，消毒后转移至MS培养基中；
(b)曼陀罗组培苗培养：将步骤(a)的消毒茎尖在MS培养基上培养3～5周，直至其长出展开的叶片；培养条件：22～28℃，光照14～18h；
(c)原生质体酶解：在一9cm直径的细胞培养皿中，加入20mL溶液A；剪取5～7片步骤(b)组培苗展开的幼叶，快速用剪刀剪成1mm的条状，置于溶液A中，于25℃暗中静置培养2～3h后，用移液器弃溶液A，置换20mL新的溶液A，分别加入质量体积百分比为10％的纤维素酶R10溶液和质量体积百分比为10％的离析酶R10溶液各500μL，置于水平摇床中，于22～28℃黑暗条件下，以55～60rpm的转速过夜；
(d)原生质体分离：用70μm细胞筛网过滤步骤(c)的酶解液至无菌的50mL离心管中，并用20mL溶液A冲洗筛网上的叶片残渣，然后用移液器在滤液上层缓慢滴加10mL溶液B，避免与溶液A混溶；25℃下用100g离心力离心15min，用无菌吸管吸取溶液A和溶液B之间的原生质体，即得到所需的原生质体，
其中，溶液A和溶液B的试剂组成如下：
成分 溶液A/L 溶液B/L 3]]> 1.012g 1.012g 2]]> 0.332g 0.332g 4·7H2O]]> 0.370g 0.370g 2PO4]]> 0.170g 0.170g MES 1.952g 1.952g 6-苄腺嘌呤 1mg/mL 1mL 1mL 萘乙酸1mg/mL 100μL 100μL 微量无机盐溶液100× 10mL 10mL 1M琥珀酸铵溶液 20mL 20mL 维生素盐溶液100× 10mL 10mL 蔗糖 130g 20g 葡萄糖 / 65g 蒸馏水 定容至1L 定容至1L
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