[发明专利]一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法及其分子标记引物

说明书

技术领域

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种利用分子标记预示和鉴定绵羊超数排卵性状的方法。

背景技术

超数排卵(Multiple Ovulation,MO)技术是近30年来国际上发展很快的一项生物高新技术，在畜牧业发达国家，羊的超数排卵技术自上世纪末就已从实验室逐步转入了应用阶段。此项技术的应用使人们摆脱了过去对雌性动物的生殖研究和应用的限制，开始挖掘和利用优良母畜的遗传潜力，利用这项技术可以在相对较短的时间里，从一只母羊获得更多的后代，它可以比传统的方法加快几倍、几十倍繁殖优良种羊，这将大大提高优良种群的繁殖效率，促进家畜改良，加速遗传进展；同时也为生殖细胞融合、体外受精、胚胎性别鉴定、转基因技术、体细胞克隆等生物技术的研究提供基础，是上世纪继人工授精之后家畜繁殖领域的又一次重大革命。

随着超数排卵技术在畜牧生产中和科研工作中的广泛开展，一些影响其进一步发展和提高的技术问题也日益显现。超数排卵效果不稳定已成为制约其进一步推广应用的首要因素，即使供体母羊的品种、年龄、营养及生理状况，激素的来源、剂量，超数排卵的季节、程序等均相同的情况下，超数排卵效果仍然会出现很大程度的差异，不同个体在获卵数上变异很大，变异系数在40％左右，导致超数排卵的效率显著下降。

随着现代分子遗传学技术的飞速发展，分子标记技术为解决这一问题提供了新的思路。采用分子生物学技术方法可以避免年龄和环境的干扰来实现分子标记的基因型检测，利用分子标记基因型信息可以准确的选择优质供体参加超数排卵处理，减小获卵数变异，这样必将极大地加快育种进程，提高家畜生产效率。

促卵泡激素又名卵泡刺激素(Follicle-Stimulating Hormone，FSH)，在生殖过程中扮演着重要的角色，同时也是超数排卵处理过程中最为重要的一种外源补充激素。但促卵泡激素本身不能直接透过细胞膜，必须与靶组织的颗粒细胞、内膜细胞上的促卵泡激素受体(FSH receptor，FSHR)结合，才能进入细胞内发挥其生物学作用。绵羊FSHR基因位于3号染色体，Yarney等(1993)首先克隆了其cDNA序列，此序列包括长2085bp的开放阅读框，编码678个氨基酸的成熟蛋白质(74,580daltons；pI＝6.78)。与已知的人和大鼠的序列同源性超过90％。FSHR的mRNA位于卵泡颗粒细胞的表面，在卵泡发育初期、卵泡内膜和基质膜形成以前，原始卵泡只有1～2层颗粒细胞时就能发现。FSHR与其配体结合，使颗粒细胞或睾丸细管滋养层细胞cAMP浓度升高，使蛋白激酶A(PKA)活化，导致一些蛋白酶和转录因子激活。转录因子cAMP反应元件结合蛋白和cAMP反应结合效应物被PKA磷酸化而激活，与CRE(cAMP反应元件)结合，导致特定阶段的mRNA转录。

因此，促卵泡激素受体基因(FSHR)可以被选定为候选基因，通过寻找其具有重要功能的分子标记，并利用分子标记信息进行供体选择，对于提高绵羊超数排卵效率具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于克隆绵羊促卵泡激素受体(FSHR)基因片段，鉴定其特定的突变位点，而提供一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法及其分子标记引物。

本发明根据绵羊FSHR基因5＇调控区c.-365C>T突变(C-365T)，采用引物单碱基错配方式，巧妙设计了特异性引物FSHRPF和FSHRPR，成功屏蔽掉引物区域内基因组上的原有干扰酶切位点，只保留扩增区段中用于C-365T突变检测的酶切位点。采用限制性内切酶Sau3AI对C-365T突变位点进行检测分型，利用基因型信息与绵羊超数排卵性状的关联性，提供一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法。

本发明提供一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记引物，该分子标记引物为FSHRPF和FSHRPR，FSHRPF的序列如序列表Seq ID No：1所示，FSHRPR的序列如序列表Seq ID No：2所示。

本发明的一种预示和鉴定绵羊超数排卵性状的分子标记方法，它是按照以下步骤进行的：

一、以提取的绵羊基因组DNA为模板，采用FSHRPF和FSHRPR引物，进行PCR扩增，收集PCR产物；取PCR产物进行凝胶电泳检测，并采用Sau3AI限制性内切酶对PCR产物进行酶切，获得酶切产物；