[发明专利]一种鼻咽癌相关EB病毒检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种生物技术领域，尤其涉及一种鼻咽癌相关EB病毒检测试剂盒及检测方法。

背景技术

EB病毒(EBV)在世界各地感染比较普遍，成人超过90％均曾感染过。EB病毒感染可引起传染性单核细胞增多症，与Burkitt淋巴瘤、Hodgkin病和鼻咽癌(NPC)等密切相关。目前研究发现EBV感染与多种人类肿瘤发生相关。包括伯基特淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、胃癌、鼻咽癌等。EBV在这些肿瘤发生中起到相当重要的作用，因此在1997年已经把EBV归为第一类致癌物。近年来研究人员发现血浆游离EBV-DNA是一种可靠的监测指标，对鼻咽癌的诊断、监测疗效及预后判断等方面都起到很好的作用。检测EBV-DNA含量对高危地区NPC患者进行筛查和和辅助诊断有很高的实用价值。

目前ELISA检测EBV各项抗体是临床诊断EBV感染的重要指标之一，但它实际上检测的是人体对EBV感染的免疫反应状态，无法检测病毒自身，也就无法准确灵敏地反映EBV感染的情况。由于鼻咽癌外周血循环的游离EBV-DNA的拷贝数随着全身化疗周期的进行而呈现动态变化，所以检测鼻咽癌患者EBV-DNA的表达水平对判断病灶残留、复发、转移、判断治疗的敏感性、综合治疗方案的及时更改、确认以及判断疗效、预后均具有重要的指导意义，EBV目前已经成为鼻咽癌诊治中重要的血清分子标志物，可以作为诊断和治疗中的一项参考依据。

目前国外已经上市的检测EBV-DNA的试剂盒有几种，检测的方法主要是荧光免疫杂交(HIGH)，国内检测EBV主要采用ELISA方法，未见有批准上市检测EBV-DNA的试剂盒。基于EBV感染情况如此严重，开发一种简单、易行、成本较低的检测方法就显得尤为重要。

发明内容

本发明旨在解决现有技术的不足，而提供一种鼻咽癌相关EB病毒检测试剂盒及检测方法。

本发明为实现上述目的，采用以下技术方案：一种鼻咽癌相关EB病毒检测试剂盒，该试剂盒含有：

(1)EB-PCR反应液：包括buffer、dNTPs、taq酶；

(2)第一EB引物探针液：包括第一EB引物、第一EB探针；

(3)第二EB引物探针液；包括第二EB引物、第二EB探针；

(4)临界阳性质控品：为含有扩增目的基因片段的重组质粒；

(5)阳性质控品：为含有扩增目的基因片段的重组质粒；

(6)阴性质控品：DEPC水；

所述第一EB引物，序列如下：

正向引物：TACGCTTTGTTCCTTARA；

反向引物：GTCAGGATAGCAAGAATR；

所述第一EB探针，序列如下：

TTACTGATTGTCGCTGGCATACTCT；

由所述第一EB引物与第一EB探针扩增出的第一DNA序列为：TTACGCTTTGTTCCTTAGATTTGTTCTGCATGTTATTACTGATTGTCGCTGGCATACTCTTCATTCTTGCTATCCTGACCGAATG；

所述第二EB引物，序列如下：

正向引物：CTGGACACTTATGTTTCAA；

反向引物：GGGACAATATCAGGCTAA；

所述第二EB探针，序列如下：

FAM-TATGGTCACTCAGGCACGGTC--BHQ1

由所述第二EB引物与第二EB探针扩增出的第二DNA序列为：CTGGACACTTATGTTTCAAGCAGCTCACCTATGGTCACTCAGGCACGGTCGCCCCTCCGAGTGACCAGTCACCTTCCAGACTATGCATACACTGAATTTAGCCTGATATTGTCCC；

本发明还提供一种利用上述试剂盒检测鼻咽癌相关EB病毒的检测方法：包括以下步骤：

(1)标本提取：根据标本的不同选择不同的提取方式：咽拭子样本、组织及鼻咽部石蜡切片，选择相应的试剂盒，按照其说明书和注意事项进行提取即可。EB病毒的阳性质控品、阴性质控品和临界阳性质控品无需抽提，使用前室温融化混匀；

(2)试剂配置：

A、在试剂准备区内将盒内各组分取出，于室温充分融化之后，短暂震荡，瞬时离心，算加到反应混合物中的量；

B、取1.5mL离心管配置反应体系，试剂全部加入后震荡混匀，瞬时离心；